本发明涉及一种基于2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的电化学免疫传感器的制备方法，具体是以2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳与神经元特异性烯醇化酶一抗结合形成一抗标记物，fe-zif负载硫化铜量子点复合材料作为二抗标记物标记神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗，制备了一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心猝灭型电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术：
肺癌是目前已知的最致命的癌症之一，主要分为小细胞肺癌（sclc）和非小细胞肺癌（nsclc）。小细胞肺癌以其早期转移迅速和快速倍增时间而闻名，由于其最初对化疗的高敏感性和耐药性而难以治疗。研究报道，神经元特异性烯醇化酶（nse）是早期诊断sclc的可靠、特异、敏感的血清生物标志物，可评估患者的康复进展。因此，nse水平的测定对于临床诊断中监测sclc的进展和治疗效果具有重要意义。电致化学发光作为电化学和发光两种技术结合的新兴产物，具有背景低、动态范围宽、仪器设备简便和检测灵敏等优点，在生物分析、食品安全分析和环境污染监测等领域受到广泛的关注。
类石墨相氮化碳具有独特的电子和能带结构，生物相容性好，因其制备简单、化学稳定性好和易于调控的性能常用作于催化剂或良好载体。近年来，研究者开始聚焦于类石墨相氮化碳的电化学发光性能，将其应用于电化学免疫传感器领域，然而原始的类石墨相氮化碳因其电化学发光较弱且发光信号不稳定，大大限制了其在免疫传感器领域中的应用。本发明采用2,4,6-三氨基嘧啶精确调控类石墨相氮化碳的电化学发光性能，通过引入不同量的2,4,6-三氨基嘧啶与三聚氰胺共聚，改变类石墨相氮化碳网络结构的电子排布，准确的将三嗪环结构中的部分氮原子替换成碳原子，赋予了其优异的电化学发光行为，大大扩展了类石墨相氮化碳的应用前景。
电化学免疫传感器是基于物质的电光信号转换特性来确定待测物浓度的一类检测装置。常见的构建过程需要层层修饰，过程复杂且影响免疫分子的生物活性。本发明基于2,4,6-三氨基嘧啶精确调控的类石墨相氮化碳构建了一种新型的电化学免疫传感器，用于神经元特异性烯醇化酶的检测。利用2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳作为基底发光材料，其生物相容性好、信号稳定且抗干扰能力强，使其先与神经元特异性烯醇化酶的一抗结合形成一抗标记物。另外，使用fe-zif负载硫化铜量子点作为猝灭材料，可实现很好的发光信号猝灭效果。这是因为fe-zif负载硫化铜量子点的紫外吸收光谱与调控后的类石墨相氮化碳的电化学发光发射光谱有很大重叠，所以基于共振能量转移原理可以实现高效猝灭。将fe-zif负载硫化铜量子点用于标记神经元特异性烯醇化酶的二抗作为二抗标记物，实现了对神经元特异性烯醇化酶的超灵敏检测，检测限为21.6fgml-1。本发明所构建的电化学免疫传感器与常规传感器相比构建层数减少，构建传感器过程简单易行。基于材料的优异性能和精简的检测方法，本发明的电化学免疫传感器灵敏度高，检出限低，稳定性好。基于上述发现，发明人完成了本发明。
技术实现要素：
本发明的目的之一是采用2,4,6-三氨基嘧啶精确调控的类石墨相氮化碳作为基底发光材料，准确的将三嗪环结构中的氮原子替换成碳原子，赋予了其优异的电化学发光行为，良好的生物相容性、稳定的电化学信号和优异的抗干扰能力，可以使其与神经元特异性烯醇化酶的一抗相连形成稳定的一抗标记物，精简了传感器的构建过程。
本发明的目的之二是使用fe-zif负载硫化铜量子点作为猝灭材料，因其紫外吸收光谱与改性的类石墨相氮化碳的电化学发光发射光谱有很大重叠，所以基于共振能量转移能够实现高效猝灭，为构建电化学免疫传感器提供了新的共振能量转移供体-受体对。
本发明的目的之三是提供一种新型基于共振能量转移的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，该方法将基底发光材料和猝灭材料分别标记待测物的一抗和二抗，使传感器的制备更加简单方便，且稳定性好、灵敏度高和重现性好。
本发明的目的之四是实现了所述电化学免疫传感器的构建并且对神经元特异性烯醇化酶进行了灵敏的检测，检测限为21.6fgml-1，达到了所述电化学发光传感器在检测神经元特异性烯醇化酶上的用途。
本发明的技术方案
1.一种基于2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的制备
用三聚氰胺和2,4,6-三氨基嘧啶共聚制备了2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，将1g三聚氰胺和10~50mg的2,4,6-三氨基嘧啶充分均匀地混合在玛瑙研钵中进行研磨，然后将混合物置于带盖的坩埚中，在马弗炉中以5℃min-1升温速率升至550℃保持加热4h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，不添加2,4,6-三氨基嘧啶时，其他条件都相同，制备了原始的类石墨相氮化碳；
（2）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将5~20µgml-1的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）进行活化，然后与2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳在4℃下共同孵化6h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）fe-zif的制备
先将1~3g的2-甲基咪唑溶于30ml无水甲醇中，记为溶液a；此外将0.1~0.5g七水合硫酸亚铁和0.6~1g六水合硝酸锌混合溶于30ml无水甲醇，记为溶液b；将两种溶液混合搅拌均匀，并在35℃下不断搅拌反应4h，将反应完成的混合溶液离心，收集所得产物，并用无水甲醇洗涤离心3次，将洗涤后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，得到fe-zif粉末；
（4）硫化铜量子点的制备
将20~50mg九水合硫酸钠溶于3ml去离子水中得到硫化钠溶液备用，将50~100mg氯化铜与80~100mg柠檬酸三钠溶于300ml超纯水中，磁搅拌得到浅蓝色透明溶液，将充分溶解的溶液进行加热，于90℃下反应30min，在加热过程中缓慢滴加上述硫化钠溶液，在这过程中可以观察到溶液逐渐变为墨绿色，且有沉淀生成，将反应完成后的悬浮液离心，收集所得产物，并用超纯水洗涤离心3次，将洗涤过后的硫化铜量子点悬浮液溶于5ml去离子水中在4℃下保存备用；
（5）fe-zif负载硫化铜量子点复合材料的制备
将制得的50~100mg的fe-zif粉末溶于300ml去离子水中，磁搅拌使其充分分散溶解，然后缓慢滴加上述硫化铜量子点悬浮液，使fe-zif对硫化铜量子点进行充分负载，搅拌8h后将混合溶液进行离心，收集所得产物，并用去离子水洗涤离心3次，将洗涤过后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，即得到fe-zif负载硫化铜量子点复合材料；
（6）pbs缓冲溶液的配置
取11.94g十二水合磷酸氢二钠定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为甲液；取4.54g磷酸二氢钾定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列ph在6.0~8.0的pbs缓冲溶液；
（7）fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将20~100μl神经元特异性烯醇化酶二抗（10μgml-1）加入到1ml1~3mgml-1fe-zif负载硫化铜量子点复合材料水溶液中，并在4℃下震荡孵化12h，离心后将得到的产物分散在1mlpbs中，即得fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（8）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6µl、0.5~2.5mgml-1的2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3µl、质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；
3）继续滴加6µl、0.00005~100ngml-1的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2h，超纯水冲洗，室温下晾干；
4）最后滴加6µl的fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
2.电化学免疫传感器的检测方法如下：
（1）将ag/agcl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为500~800v，在含有20~100mmoll-1过硫酸钾的的pbs缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.6~0v；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线；
（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测。
本传感器对神经元特异性烯醇化酶抗原的检测线性范围为0.00005~100ngml-1，检测限为21.6fgml-1。
合成材料所需要的化学试剂均为当地试剂店购得，没有经过再处理。
本发明的有益成果
（1）本发明采用2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳作为基底发光材料，准确地将类石墨相氮化碳三嗪环结构中的部分氮原子替换成碳原子，赋予了其优异的电化学发光行为，使材料整体的电子分布得到很大改善，解决了原始类石墨相氮化碳电化学发光信号弱且发光信号不稳定的弊端，对于类石墨相氮化碳的扩展应用具有重要意义。
（2）本发明提供了一种新型共振能量转移的供体-受体对，使用2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳作为基底发光材料，使用fe-zif负载硫化铜量子点作为猝灭材料，构建了一个夹心猝灭型的电化学免疫传感器。
（3）本发明提供一种新的构建电化学免疫传感器的方法。该方法将基底发光材料和猝灭材料分别标记待测物的一抗和二抗，再识别待测抗原，使传感器的制备更加简单方便，且制备的传感器稳定性好、灵敏度高和重现性好。
（4）本发明制备的电化学免疫传感器对神经元特异性烯醇化酶进行了灵敏的检测，检测范围为0.00005~100ngml-1，检测限为21.6fgml-1，可以实现简便快捷、高灵敏、高特异性和高稳定性的检测。
具体实施方式
实施例1电化学免疫传感器的制备
（1）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的制备
用三聚氰胺和2,4,6-三氨基嘧啶共聚制备了2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，将1g三聚氰胺和10mg的2,4,6-三氨基嘧啶充分均匀地混合在玛瑙研钵中进行研磨，然后将混合物置于带盖的坩埚中，在马弗炉中以5℃min-1升温速率升至550℃保持加热4h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，不添加2,4,6-三氨基嘧啶时，其他条件都相同，制备了原始的类石墨相氮化碳；
（2）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将5µgml-1的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）进行活化，然后与2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳在4℃下共同孵化6h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）fe-zif的制备
先将1g的2-甲基咪唑溶于30ml无水甲醇中，记为溶液a；此外将0.1g七水合硫酸亚铁和0.6g六水合硝酸锌混合溶于30ml无水甲醇，记为溶液b；将两种溶液混合搅拌均匀，并在35℃下不断搅拌反应4h，将反应完成的混合溶液离心，收集所得产物，并用无水甲醇洗涤离心3次，将洗涤后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，得到fe-zif粉末；
（4）硫化铜量子点的制备
将20mg九水合硫酸钠溶于3ml去离子水中得到硫化钠溶液备用，将50mg氯化铜与80mg柠檬酸三钠溶于300ml超纯水中，磁搅拌得到浅蓝色透明溶液，将充分溶解的溶液进行加热，于90℃下反应30min，在加热过程中缓慢滴加上述硫化钠溶液，在这过程中可以观察到溶液逐渐变为墨绿色，且有沉淀生成，将反应完成后的悬浮液离心，收集所得产物，并用超纯水洗涤离心3次，将洗涤过后的硫化铜量子点悬浮液溶于5ml去离子水中在4℃下保存备用；
（5）fe-zif负载硫化铜量子点复合材料的制备
将制得的50mg的fe-zif粉末溶于300ml去离子水中，磁搅拌使其充分溶解分散，然后缓慢滴加上述硫化铜量子点悬浮液，使fe-zif对硫化铜量子点进行充分负载，搅拌8h后将混合溶液进行离心，收集所得产物，并用去离子水洗涤离心3次，将洗涤过后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，即得到fe-zif负载硫化铜量子点复合材料；
（6）pbs缓冲溶液的配置
取11.94g十二水合磷酸氢二钠定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为甲液；取4.54g磷酸二氢钾定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列ph在6.0~8.0的pbs缓冲溶液；
（7）fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将20μl神经元特异性烯醇化酶的二抗（10μgml-1）加入到1ml1mgml-1fe-zif负载硫化铜量子点复合材料水溶液中，并在4℃下震荡孵化12h，离心后将得到的产物分散在1mlpbs中，即得fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（8）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6µl、0.5mgml-1的2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3µl、质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；
3）继续滴加6µl、0.00005~100ngml-1的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2h，超纯水冲洗，室温下晾干；
4）最后滴加6µl的fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
实施例2电化学免疫传感器的制备
（1）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的制备
用三聚氰胺和2,4,6-三氨基嘧啶共聚制备了2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，将1g三聚氰胺和30mg的2,4,6-三氨基嘧啶充分均匀地混合在玛瑙研钵中进行研磨，然后将混合物置于带盖的坩埚中，在马弗炉中以5℃min-1升温速率升至550℃保持加热4h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，不添加2,4,6-三氨基嘧啶时，其他条件都相同，制备了原始的类石墨相氮化碳；
（2）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将10µgml-1的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）进行活化，然后与2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳在4℃下共同孵化6h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）fe-zif的制备
先将2g的2-甲基咪唑溶于30ml无水甲醇中，记为溶液a；此外将0.3g七水合硫酸亚铁和0.8g六水合硝酸锌混合溶于30ml无水甲醇，记为溶液b；将两种溶液混合搅拌均匀，并在35℃下不断搅拌反应4h，将反应完成的混合溶液离心，收集所得产物，并用无水甲醇洗涤离心3次，将洗涤后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，得到fe-zif粉末；
（4）硫化铜量子点的制备
将30mg九水合硫酸钠溶于3ml去离子水中得到硫化钠溶液备用，将80mg氯化铜与90mg柠檬酸三钠溶于300ml超纯水中，磁搅拌得到浅蓝色透明溶液，将充分溶解的溶液进行加热，于90℃下反应30min，在加热过程中缓慢滴加上述硫化钠溶液，在这过程中可以观察到溶液逐渐变为墨绿色，且有沉淀生成，将反应完成后的悬浮液离心，收集所得产物，并用超纯水洗涤离心3次，将洗涤过后的硫化铜量子点悬浮液溶于5ml去离子水中在4℃下保存备用；
（5）fe-zif负载硫化铜量子点复合材料的制备
将制得的80mg的fe-zif粉末溶于300ml去离子水中，磁搅拌使其充分溶解分散，然后缓慢滴加上述硫化铜量子点悬浮液，使fe-zif对硫化铜量子点进行充分负载，搅拌8h后将混合溶液进行离心，收集所得产物，并用去离子水洗涤离心3次，将洗涤过后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，即得到fe-zif负载硫化铜量子点复合材料；
（6）pbs缓冲溶液的配置
取11.94g十二水合磷酸氢二钠定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为甲液；取4.54g磷酸二氢钾定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列ph在6.0~8.0的pbs缓冲溶液；
（7）fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将50μl神经元特异性烯醇化酶二抗（10μgml-1）加入到1ml2mgml-1fe-zif负载硫化铜量子点复合材料水溶液中，并在4℃下震荡孵化12h，离心后将得到的产物分散在1mlpbs中，即得fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（8）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6µl、1.5mgml-1的2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3µl、质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；
3）继续滴加6µl、0.00005~100ngml-1的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2h，超纯水冲洗，室温下晾干；
4）最后滴加6µl的fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
实施例3电化学免疫传感器的制备
（1）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的制备
用三聚氰胺和2,4,6-三氨基嘧啶共聚制备了2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，将1g三聚氰胺和50mg的2,4,6-三氨基嘧啶充分均匀地混合在玛瑙研钵中进行研磨，然后将混合物置于带盖的坩埚中，在马弗炉中以5℃min-1升温速率升至550℃保持加热4h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳，不添加2,4,6-三氨基嘧啶时，其他条件都相同，制备了原始的类石墨相氮化碳；
（2）2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将20µgml-1的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）进行活化，然后与2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳在4℃下共同孵化6h，得到2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）fe-zif的制备
先将3g的2-甲基咪唑溶于30ml无水甲醇中，记为溶液a；此外将0.5g七水合硫酸亚铁和1g六水合硝酸锌混合溶于30ml无水甲醇，记为溶液b；将两种溶液混合搅拌均匀，并在35℃下不断搅拌反应4h，将反应完成的混合溶液离心，收集所得产物，并用无水甲醇洗涤离心3次，将洗涤后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，得到fe-zif粉末；
（4）硫化铜量子点的制备
将50mg九水合硫酸钠溶于3ml去离子水中得到硫化钠溶液备用，将100mg氯化铜与100mg柠檬酸三钠溶于300ml超纯水中，磁搅拌得到浅蓝色透明溶液，将充分溶解的溶液进行加热，于90℃下反应30min，在加热过程中缓慢滴加上述硫化钠溶液，在这过程中可以观察到溶液逐渐变为墨绿色，且有沉淀生成，将反应完成后的悬浮液离心，收集所得产物，并用超纯水洗涤离心3次，将洗涤过后的硫化铜量子点悬浮液溶于5ml去离子水中在4℃下保存备用；
（5）fe-zif负载硫化铜量子点复合材料的制备
将制得的100mg的fe-zif粉末溶于300ml去离子水中，磁搅拌使其充分溶解分散，然后缓慢滴加上述硫化铜量子点悬浮液，使fe-zif对硫化铜量子点进行充分负载，搅拌8h后将混合溶液进行离心，收集所得产物，并用去离子水洗涤离心3次，将洗涤过后的产物于60℃真空干燥箱中烘干过夜，即得到fe-zif负载硫化铜量子点复合材料；
（6）pbs缓冲溶液的配置
取11.94g十二水合磷酸氢二钠定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为甲液；取4.54g磷酸二氢钾定容于500ml的容量瓶中配置成浓度为1/15moll-1的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列ph在6.0~8.0的pbs缓冲溶液；
（7）fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将100μl神经元特异性烯醇化酶二抗（10μgml-1）加入到1ml3mgml-1fe-zif负载硫化铜量子点复合材料水溶液中，并在4℃下震荡孵化12h，离心后将得到的产物分散在1mlpbs中，即得fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（8）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6µl、2.5mgml-1的2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3µl、质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；
3）继续滴加6µl、0.00005~100ngml-1的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2h，超纯水冲洗，室温下晾干；
4）最后滴加6µl的fe-zif负载硫化铜量子点并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
实施例4神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将ag/agcl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为500v，在含有20mmoll-1过硫酸钾的pbs缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.6~0v；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
实施例5神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将ag/agcl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为600v，在含有50mmoll-1过硫酸钾的pbs缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.5~0v；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
实施例6神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将ag/agcl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为700v，在含有80mmoll-1过硫酸钾的pbs缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.4~0v；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
实施例7神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将ag/agcl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为800v，在含有100mmoll-1过硫酸钾的pbs缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.3~0v；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。