1.本发明涉及食品检测，尤其是一种用于检测牛肉掺假的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
2.食品安全是关系民生的一件大事，在如今的市场经济中，有不法商家为了追求高额利润，不惜添加一些危害人体的添加剂，有的则以次充好，将便宜的东西添加进高价产品中，如使用马肉、鸭肉等低价值肉品冒充牛肉等。对食品的检测就能有效的打击这种作假的行为，但现有的检测方法主要通过dna分析和pcr检测，它们耗时都较长，检测仪器设备费用贵，进而导致检测成本偏高。检测试剂盒则是一种低成本快速检测的有效手段，但现有的商品化的牛源检测试剂盒只能检测出样本中是否含有牛肉成分，无法检测出是否掺有其它肉种，如需确定是否掺有其他肉种，需要逐一用其它动物源性试剂盒检测，检测繁琐，检测中也容易出现误差，进而导致检测结果不够准确。
技术实现要素：
3.针对现有的不足，本发明提供一种用于检测牛肉掺假的检测试剂盒及其制备方法。
4.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测牛肉掺假的检测试剂盒，包括多条由nc膜制成的检测试纸条、与检测试纸条相同数量的胶体金冻干粉微孔、一定体积的样本提取液和样本稀释液；所述检测试纸条是包被有兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体、山羊抗鼠源igg多克隆抗体的试纸条；所述胶体金冻干粉微孔是胶体金颗粒标记有鼠源抗牛源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗马源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗鸭源特异性蛋白单克隆抗体的微孔。
5.作为优选，所述样本提取液包括提取液a和提取液b，所述提取液a包括有如下重量百分比的组分：pmsf 0.1-1％、丙酮5-10％、异丙醇89-94.9％；所述提取液b包括如下重量百分比的组分：edta 0.01-0.1％、甲醇20％、三氯乙酸0.01-0.1％；所述提取液a和提取液b的体积比为1:10。
6.作为优选，所述样本稀释液包括有如下如下重量百分比组分：ph值为7.1-7.4的浓度为0.1m的pbs 89.4-98.98％、甲醇1-10％、吐温-20 0.01-0.5％、防腐剂0.01-0.1％。
7.作为优选，所述样本稀释液和样本提取液的体积比为1:11。
8.一种用于检测牛肉掺假的检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
9.s1，检测试纸条的制备，将纯化过后的兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体、山羊抗鼠源igg多克隆抗体，用缓冲液分别稀释成一定浓度的包被液，之后将包被液分别加入划膜仪加样槽中，以给定的划线宽度在nc膜上进行包被形成层析膜，包被完毕将层析膜在指定温湿度下放置多个
小时；最后将层析膜、吸水纸、样品垫粘贴在底板上形成检测试纸条；
10.s2，胶体金冻干粉微孔的制备，在胶体金颗粒溶液中分别标记鼠源抗牛源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗马源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗鸭源特异性蛋白单克隆抗体，之后将标记好的胶体金颗粒溶液加入酶标板的孔中并通过冻干机中冻干，最后盖上微孔板通过微孔筒分装；
11.s3，制备样本提取液和样本稀释液；
12.s4，将相同数量的检测试纸条和胶体金冻干粉微孔，以及一定体积的样本提取液和样本稀释液包装在盒体内形成一个检测试剂盒。
13.作为优选，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液，其ph值为7.0-8.0，浓度为0.02
‑‑
0.2mol/l，稀释后的兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体、山羊抗鼠源igg多克隆抗体包被液的浓度对应为4.8-5.2μg/ml、9.5-10.5μg/ml、6.8-7.2μg/ml、1.9-2.1μg/ml的，所述指定的温湿度是温度37
±
2℃、湿度30
±
5％，放置时间至少15小时，所述给定的划线宽度是0.5-1.0mm。
14.作为优选，所述底板是表面带有粘性的pvc底板，所述层析膜粘贴在底板中部，所述吸水纸粘贴在底板的上部，所述样品垫粘贴在底板的下部，所述吸水纸和样品垫均有部分覆盖在层析膜上，所述样品垫上粘贴有箭头标。
15.作为优选，所述胶体金颗粒溶液中胶体金颗粒粒径的大小是30nm
‑‑
37nm，所述胶体金颗粒溶液中所标记的鼠源抗牛源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗马源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗鸭源特异性蛋白单克隆抗体浓度比例分别为3.3-3.7ug/ml、1.9-2.1ug/ml、7.5-8.5ug/ml。
16.作为优选，所述酶标板的规格是50μl/孔的酶标板，所述冻干过程中使用有金孔冻干液，所述金孔冻干液包括有如下重量百分比的组分：ph值为7.1-7.4的浓度为0.1m的pbs 81.3-89.9％、蔗糖3-5％、海藻糖5-10％、甘露醇1-3％、β-环糊精0.1-1％、聚乙烯吡咯烷/0.1-0.5％、吐温-20 0.01-0.05％，制备时先将蔗糖、海藻糖、甘露醇加入pbs溶解，再加入β-环糊精溶解完全后加入吐温-20就制得金孔冻干液。
17.作为优选，所述样本提取液包括提取液a和提取液b，所述提取液a包括有如下重量百分比的组分：pmsf 0.1-1％、丙酮5-10％、异丙醇89-94.9％；所述提取液b包括如下重量百分比的组分：edta 0.01-0.1％、甲醇20％、三氯乙酸0.01-0.1％；所述提取液a和提取液b的体积比为1:10；所述样本稀释液包括有如下如下重量百分比组分：ph值为7.1-7.4的浓度为0.1m的pbs89.4-98.98％、甲醇1-10％、吐温-20 0.01-0.5％、防腐剂0.01-0.1％，所述样本稀释液与样本提取液的体积比为1:11。
18.本发明的有益效果在于：该发明的胶体金法采用双抗夹心的方式，在nc膜上分别预包被兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体作为t1、t2、t3线，在nc膜上包被山羊抗鼠源igg多克隆抗体作为c线，样本中的蛋白预先和金孔中的偶联胶体金颗粒抗体相结合，再和nc膜上预包被的抗体结合，如样品中含有目的蛋白则相应的t线会显色，如无目的蛋白则相应的t线不显色，能精确的检测牛肉是否掺假，在检测时能检测出肉样是否来源于牛属并能检测出样品中是否含有马肉、鸭肉成分，检测灵敏度高、特异性强，对操作人员要求不高，能满足大量样本同时快速的检测需求。
具体实施方式
19.为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
20.本发明实施例，一种用于检测牛肉掺假的检测试剂盒及其制备方法，包括多条由nc膜制成的检测试纸条、与检测试纸条相同数量的胶体金冻干粉微孔、一定体积的样本提取液和样本稀释液，检测试纸条和微孔的数量相同，样本稀释液和样本提取液的体积比则为1:11，它们的量只需满足与检测试纸条的使用即可，如32条检测试纸条，样本稀释液10ml即可；
21.此时，检测试纸条是包被有兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体、山羊抗鼠源igg多克隆抗体的试纸条，兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体就对应形成牛、马、鸭的检测线，山羊抗鼠源igg多克隆抗体形成质控线，在试纸上包被多种抗体，不仅能检测出样品来源是否属于牛肉还能检测出样品中是否哈游马肉、鸭肉等成分；其制备方法如下：将纯化过后的兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体、山羊抗鼠源igg多克隆抗体，用缓冲液分别稀释成一定浓度的包被液，之后将包被液分别加入划膜仪加样槽中，以给定的划线宽度在nc膜上进行包被形成层析膜，该层析膜就由nc膜、包被在nc膜上的抗体共同组成，包被完毕将层析膜在指定温湿度下放置多个小时，经过放置就使得缓冲液从层析膜蒸发出去；最后将层析膜、吸水纸、样品垫粘贴在底板上形成检测试纸条，缓冲液是磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液，其ph值为7.0-8.0，浓度为0.02
‑‑
0.2mol/l，稀释后的兔源抗牛源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗马源特异性蛋白多克隆抗体、兔源抗鸭源特异性蛋白多克隆抗体、山羊抗鼠源igg多克隆抗体包被液的浓度对应为5μg/ml、10μg/ml、7μg/ml、2μg/ml的，所述指定的温湿度是温度37℃、湿度30％，放置时间至少15小时，所述给定的划线宽度是0.8mm，所述底板是表面带有粘性的pvc底板，所述层析膜粘贴在底板中部，所述吸水纸粘贴在底板的上部，所述样品垫粘贴在底板的下部，所述吸水纸和样品垫均有部分覆盖在层析膜上，所述样品垫上粘贴有箭头标，同时在吸水纸上还可以粘贴有用于手捏持的手柄胶纸，箭头标则用来指示样品层析的走向，它们彼此的覆盖只是各自端部一小部分的覆盖，此时样品垫采用玻璃纤维、吸水纸采用纤维素、箭头标和手柄胶纸均采用聚丙烯薄膜；
22.所述胶体金冻干粉微孔是胶体金颗粒标记有鼠源抗牛源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗马源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗鸭源特异性蛋白单克隆抗体的微孔，其制备方法如下，在胶体金颗粒溶液中分别标记鼠源抗牛源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗马源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗鸭源特异性蛋白单克隆抗体，之后将标记好的胶体金颗粒溶液加入酶标板的孔中并通过冻干机中冻干，最后盖上微孔板通过微孔筒分装，此时胶体金颗粒溶液是提前制备好的，酶标板则采用规格是50μl/孔的酶标板，在冻干机中冻干16小时，之后盖上微孔盖，用专用的微孔筒按4条/筒的方式分装，每条8孔制得胶体金冻干粉微孔，在使用时根据要检测的数量来选择对用数量的微孔即可；
23.所述胶体金颗粒溶液中胶体金颗粒粒径的大小是30nm
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37nm，所述胶体金颗粒溶液中所标记的鼠源抗牛源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗马源特异性蛋白单克隆抗体、鼠源抗鸭源特异性蛋白单克隆抗体浓度比例分别为3.5ug/ml、2ug/ml、8ug/ml，制备胶体金颗粒溶液时，取500ml的圆底烧瓶，量取300ml的超纯水在磁力搅拌器的搅拌下加入1％的氯金酸2.5ml,开启加热，煮沸3分钟，在搅拌、加热的同时加入5ml 1％的柠檬酸三钠，等到液体的颜色变成玫酒红色后再继续煮10分钟，停止加热，盖上锡纸冷却至室温，4℃条件下用3000r/min离心20分钟，吸取上层金溶液存放备用，其中的氯金酸和柠檬酸三钠的1％的溶液均是称取1g用去离子水定容至100ml；
24.所述酶标板的规格是50μl/孔的酶标板，所述冻干过程中使用有金孔冻干液，金孔冻干液就用来保护胶体金颗粒和标记的抗体，同时也确保在冻干过程中冻干粉末呈现有序的疏松结构，便于使用时溶解；其组成如下，均为重量百分比，配方一：0.01m pbs(ph 7.4)81.39％、蔗糖5％、海藻糖10％、甘露醇3％、β-环糊精0.1％、聚乙烯吡咯烷酮0.5％、吐温-20 0.01％；配方二：0.01mpbs(ph 7.4)89.85％、蔗糖3％、海藻糖5％、甘露醇1％、β-环糊精1％、聚乙烯吡咯烷酮0.1％、吐温-20 0.05％；制备时先将蔗糖、海藻糖、甘露醇加入pbs溶解，再加入β-环糊精溶解完全后加入吐温-20就制得金孔冻干液；
25.制备样本提取液和样本稀释液，所述样本提取液包括提取液a和提取液b，所述提取液a包括有如下重量百分比的组分：第一种pmsf 0.1-1％、丙酮5-10％、异丙醇89-94.9％，例如配制时，先量取90ml异丙醇，再往里加入1gpmsf，缓慢搅拌溶解，之后加入10ml丙酮搅拌均匀100ml配制量，最后按照10ml/瓶的规格分装；所述提取液b包括如下重量百分比的组分：edta 0.01-0.1％、甲醇20％、三氯乙酸0.01-0.1％，如称取0.024gedta溶于80ml去离子水中，再加入0.016g三氯乙酸固体；溶解完全后加入20ml甲醇，搅拌均匀，同样也可以按照10ml/瓶的规格分装或50ml/瓶的规格分装；所述提取液a和提取液b的体积比为1:10，就意味着同一个试剂盒中，放置10ml的提取液a时，就放置100ml提取液b。
26.对于样本稀释液来说，所述样本稀释液包括有如下如下重量百分比组分：ph值为7.1-7.4的浓度为0.1m的pbs 89.4-98.98％、甲醇1-10％、吐温-200.01-0.5％、防腐剂0.01-0.1％，如采用0.1mpbs(ph 7.2)94.96％、甲醇5％、吐温-20 0.01％、防腐剂选择proclin300既可以防腐也可以显色0.03％，配制时先将pbs和甲醇混合，后加入吐温和proclin300，搅拌均匀。其和样本提取液的体积比为1:11，即在一个试剂盒中放置10ml样本稀释液，那么样本提取液就是110ml，在样本提取液由样本提取液a和样本提取液b组成时，它们之间的体积比例就是样本稀释液：样本提取液a：样本提取液b＝1:1:10。
27.最后，将相同数量的检测试纸条和胶体金冻干粉微孔，以及一定体积的样本提取液和样本稀释液包装在盒体内形成一个检测试剂盒，一个检测试剂盒中就放置32条检测试纸条，相应的就是32胶体金冻干粉微孔，检测试纸条就用切条机裁切为4mm宽的的试纸条，用专用的试纸筒按8条/筒分装，每盒4筒，同时每盒中就相应的包装1瓶10ml的样本稀释液，1瓶10ml的样本提取液a，2瓶50ml的样本提取液b，再对应的包装32支滴管，方便使用。
28.使用该试剂盒的具体操作方法如下：
29.1、牛肉组织样本处理过程：
30.1)称2.0
±
0.05g均质后的组织样本于50ml离心管中；加入3ml样本提取液b，再加入0.1ml样本提取液a；剧烈涡旋振荡10min或超声振荡2min；
31.2)15℃4000r/min离心10min；
32.3)取上清液0.3ml于10ml离心管中，加入样本稀释液0.3ml，再加入正己烷3ml，涡旋振荡1min；
33.4)15℃4000r/min离心5min；
34.5)取下层100μl液体用于分析。
35.2、检测操作步骤：
36.1)微孔孵育器预先预热20min；
37.2)取出需要数量的微孔，将不用的微孔放入微孔筒，保存于2-8℃；
38.3)加入提取的液体100μl于微孔中，并用移液器吸打致干粉溶解；
39.4)置于微孔孵育器上孵育10min；
40.5)向微孔中放入试纸条；
41.6)静置5min后观察结果；
42.3、结果判定：
43.1)如c线显色则证明此次检测有效，如c线不显色证明此试纸条无效；
44.2)如t1线显色证明样品中含有牛肉组织，如不显色则证明样品中不含有牛肉组织；
45.3)如t2线显色证明样品中含有马肉组织，如不显色则证明样品中不含有马肉组织；
46.4)如t3线显色证明样品中含有鸭肉组织，如不显色则证明样品中不含有鸭肉组织。
47.应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。