一种测定山茱萸及茱萸相关制剂中莫诺苷和马钱苷含量的方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种测定山茱萸及茱萸相关制剂中莫诺苷和马钱苷含量的方法。


背景技术：

2.山茱萸为山茱萸科山茱萸属的植物山茱萸cornus officinalissieb.et zucc.的干燥成熟果肉，秋末冬初果皮变红时采收果实，用文火烘或置沸水中略烫后，及时除去果核，干燥。山茱萸产于山西、陕西、甘肃、山东、江苏、安徽、浙江等省，其在朝鲜、日本也有分布，具有补益肝肾，收涩固脱等功效，用于眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩涌带下，大汗虚脱，内热消渴。
3.山茱萸主要化学成分有环烯醚萜类、鞣质类、黄酮类等，其中环烯醚萜苷类是山茱萸发挥传统功效的主要物质基础，目前多以环烯醚萜类来评价山茱萸质量。《中国药典》2020年版山茱萸项下以莫诺苷和马钱苷进行含量测定控制，在实际分析中，常有杂质峰干扰，且基线不稳，方法通用性差等缺点，对于山茱萸及其相关制剂中主要药效物质成分很难实现良好检测效果和方法通用性强并重。因此，有必要建立一个高灵敏和精准度，又重现性好、实用简便又通用的含量测定方法。


技术实现要素：

4.针对以上技术现状，本发明提供一种改进的山茱萸及茱萸相关制剂中莫诺苷和马钱苷含量测定方法。具体发明如下：
5.本发明提供一种改进的山茱萸及茱萸相关制剂中莫诺苷和马钱苷含量测定方法，所述方法包括：
6.(1)山茱萸及茱萸相关制剂供试品溶液的制备；(2)莫诺苷和马钱苷混合对照品溶液的制备；(3)采用hplc法测定供试品溶液莫诺苷和马钱苷的含量，其色谱条件为：c18柱，流动相为磷酸溶液(a)-乙腈：磷酸溶液(b)，梯度洗脱，柱温35℃，流速1ml/min，检测波长240nm，进样量为10μl，梯度洗脱方式为0-5min，流动相a的体积分数由78％变至75％；5-20min，流动相a的体积分数由75％变至72％；20-38min，流动相a的体积分数由72％变至60％。
7.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中山茱萸及茱萸相关制剂供试品溶液的制备包括如下：取供试品粉末，用甲醇水溶液做溶剂进行提取，取滤液即得供试品溶液。
8.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中提取溶剂为甲醇水溶液，优选50％甲醇溶液。
9.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括步骤(1)中提取方式可以是超声或回流，优选超声。
10.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括步骤(1)中提取料液比为0.05g:25ml～0.2g:25ml，优选0.1g:25ml。
11.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括步骤(1)中提取时间为30min～90min，优选30min。
12.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)中莫诺苷和马钱苷混合对照品溶液的制备包括如下：精密称定莫诺苷和马钱苷，用甲醇水溶液做溶剂制成混合对照品溶液。
13.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)中溶剂优选50％甲醇溶液，制成每1ml分别含莫诺苷60ug，马钱苷40ug的混合对照品溶液。
14.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括步骤(3)中流动相为0.3％磷酸溶液(a)-乙腈：0.3％磷酸溶液(b)，优选体积比为1:3的乙腈：0.3％磷酸溶液作为流动相b。
15.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：
16.(1)色谱条件：色谱柱waters xbridge c18(4.6*150mm，3.5um)；流动相为0.3％磷酸溶液(a)-乙腈：0.3％磷酸溶液(1:3，v/v)(b)梯度洗脱，柱温35℃，流速1ml/min，检测波长240nm，洗脱梯度为：0-5min，流动相a的体积分数由78％变至75％；5-20min，流动相a的体积分数由75％变至72％；20-38min，流动相a的体积分数由72％变至60％。
17.(2)对照品溶液制备：取莫诺苷对照品、马钱苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml分别含莫诺苷60ug，马钱苷40ug的混合对照品溶液；
18.(3)供试品溶液制备：取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声30分钟(40khz，500w)，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
19.(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
20.本发明通过色谱条件的优化、供试品制备方法的考察及方法学验证，建立了山茱萸及其相关制剂中莫诺苷和马钱苷含量测定方法，实现的色谱峰的良好分离，色谱峰型较好，峰干扰少，且基线平稳，方法通用性更强。本发明建立的含量测定方法，较文献及法定方法更加环保、科学、经济、实用、简便，结果准确可靠，可为山茱萸、酒萸肉及含山茱萸或酒萸肉制剂中质量标准及质量评价提供方法依据。
附图说明
21.图1为实施例中山茱萸hplc色谱图。
22.图2为实施例中酒萸肉hplc色谱图。
23.图3为实施例中六味地黄片hplc色谱图。
24.图4为实施例中采用不同色谱柱所得山茱萸hplc色谱图。
25.图5为实施例中采用不同色谱柱所得酒萸肉hplc色谱图。
26.图6为实施例中采用不同色谱柱所得六味地黄片hplc色谱图。
27.图7为实验例2.2中峰纯度结果图。
28.图8为对比例中山茱萸hplc色谱图。
29.图9为对比例中酒萸肉hplc色谱图。
30.图10为对比例中采用不同色谱柱所得山茱萸hplc色谱图。
31.图11为对比例中采用不同色谱柱所得酒萸肉hplc色谱图。
具体实施方式
32.以下实施例和试验例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
33.以下实施例或实验例或对比例所用物，仪器与试剂具体如下：
34.高效液相色谱仪(waters e2695，沃特世科技有限公司)；
35.色谱柱waters xbridge c18(4.6*150mm，3.5um)；
36.电子天平(xse205du，mettler toledo)；
37.电子天平(me 204，mettler toledo；
38.电子天平(pl403，mettler toledo)；
39.莫诺苷(111998-201703，中国食品药品检定研究院)；
40.马钱苷(111640-201808，中国食品药品检定研究院)；
41.磷酸(10015408，国药集团，优级纯)；
42.甲醇(20200110，北京化工厂，分析纯)；
43.乙腈(11006830917，默克，色谱纯)；
44.纯水(milli-q制备)。
45.实施例1～13山茱萸药材中莫诺苷和马钱苷含量的测定
46.本实施例1～13采用本发明方法分别对不同批次的山茱萸中莫诺苷和马钱苷的含量进行了测定；
47.色谱柱waters xbridge c18(4.6*150mm，3.5um)，流动相为0.3％磷酸溶液(a)-乙腈：0.3％磷酸溶液(1:3，v/v)(b)梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长240nm。洗脱梯度为：0-5min，流动相a的体积分数由78％变至75％；5-20min，流动相a的体积分数由75％变至72％；20-38min，流动相a的体积分数由72％变至60％；
48.对照品溶液的配制：取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声30分钟(40khz，500w)，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
49.供试品溶液的配制：取莫诺苷对照品、马钱苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml分别含莫诺苷60ug，马钱苷40ug的混合对照品溶液；
50.测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得；
51.样品：山茱萸药材，编号为：s1 s2 s3 s4 s5 s6 s7 s8 s9 s10 s11 s12s13，结果见表1。
52.表1山茱萸含量测定结果
53.编号莫诺苷(％)马钱苷(％)总量(％)s11.590.782.37s21.340.822.16s31.621.012.63
s40.980.741.72s51.110.781.89s61.580.852.43s71.550.812.36s81.610.842.45s91.420.832.25s101.470.812.28s111.590.892.49s121.350.752.09s131.310.812.12
54.本发明建立的hplc法测定山茱萸及其相关制剂中莫诺苷和马钱苷含量测定方法，所得hplc色谱图见山茱萸图1、酒萸肉图2、六味地黄片图3。说明：图1中莫诺苷(t＝12.098)，马钱苷(t＝29.495)；图2中莫诺苷(t＝13.682)，马钱苷(t＝31.839)；图3中莫诺苷(t＝11.893)，马钱苷(t＝28.974)。
55.依据本发明建立的莫诺苷和马钱苷hplc含量测定方法，采用不同色谱柱分析，测定山茱萸及其相关制剂中莫诺苷和马钱苷含量，所得hplc色谱图见山茱萸图4、酒萸肉图5、六味地黄片图6，由此可见，采用该方法分析山茱萸、酒萸肉及含山茱萸或酒萸肉制剂，以及采用不同色谱柱对山茱萸、酒萸肉及含山茱萸或酒萸肉制剂分析分析方法稳定，杂质峰干扰少，耐用性好，方法通用性更强。
56.验证实验例
57.本发明以下实验例2.1～2.7是对含量测定方法的方法学评价，按照确定的条件分别依次进行系统适应性、专属性、线性范围、重复性、中间精密度、稳定性、准确度、耐用性的实验。
58.实验例2.1系统适应性试验
59.以对照品溶液和供试品溶液对色谱系统的系统适应性进行考察。结果见表2和表3
60.表2莫诺苷系统适应性结果
[0061][0062]
表3马钱苷系统适应性结果
[0063][0064]
对照品溶液连续进样5次，莫诺苷、马钱苷峰面积的rsd均小于2.0％，保留时间rsd均小于1.0％，供试品溶液中莫诺苷和马钱苷理论板数符合要求，拖尾因子小于1.5，分离度大于1.5，方法可行。
[0065]
实验例2.2专属性试验
[0066]
取空白溶剂(50％甲醇)、流动相、对照品溶液和供试品溶液进样检测。结果见图7和表4
[0067]
表4莫诺苷和马钱苷峰纯度结果
[0068][0069]
结果显示空白溶剂及流动相对对照品及样品均没有干扰，供试品溶液中莫诺苷和马钱苷色谱峰无干扰，本方法专属性良好。
[0070]
实验例2.3线性范围试验
[0071]
对照品储备液：精密称取莫诺苷对照品、马钱苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml分别含莫诺苷300μg和马钱苷200μg的混合对照品溶液，即得；
[0072]
精密吸取对照储备液适量，制成系列溶度溶液，计算莫诺苷和马钱苷回归方程、回归方程相关系数、y轴上的截距、斜率、各浓度响应因子rsd。
[0073]
结果见表5和表6
[0074]
表5马钱苷线性测试结果
[0075][0076]
表6莫诺苷线性测试结果
[0077][0078]
从结果看，相关系数大于0.999；y轴截距小于100％浓度峰面积的2％；各浓度响应因子rsd小于2.0％，线性关系良好。
[0079]
实验例2.4重复性试验
[0080]
取本品粉末约0.2g，按实施例1方法进行制，平行配制6份，计算莫诺苷、马钱苷及总量。结果见表7
[0081]
表7含量重复性测试结果
[0082][0083]
6份供试品中莫诺苷、马钱苷及总含量结果rsd小于2.0％，符合要求。
[0084]
实验例2.5中间精密度试验
[0085]
按照重复性测定方法，由不同的分析人员，使用不同的仪器、在不同的日期进行，平行配制相同批次6份供试品溶液，与重复性结果进行比较。
[0086]
结果见表8、表9和表10
[0087]
表8马钱苷中间精密度测试结果
[0088][0089]
表9莫诺苷中间精密度测试结果
[0090][0091]
表10总含量中间精密度测试结果
[0092][0093]
由结果可知，不同人员、不同日期、不同仪器测试，12份供试品中莫诺苷、马钱苷以及总含量结果rsd不大于3.0％，符合要求。
[0094]
实验例2.6稳定性试验
[0095]
分别考察供试品溶液和对照品溶液在室温条件下放置0h、4h、8h、12h、18h、24h、48h后峰面积变化情况。结果见表11和表12
[0096]
表11莫诺苷溶液稳定性测试结果
[0097][0098]
表12马钱苷溶液稳定性测试结果
[0099][0100]
对照品和供试品溶液每个时间点的结果与初始结果相比，相对含量在98.0％～102.0％之间，说明溶液稳定性良好。
[0101]
实验例2.7准确度试验
[0102]
取本品粉末约0.1g，精密称定，平行9份，置具塞锥形瓶中，加入混合对照品溶液，按实施例1所述方法制备供试品溶液，分别制备含量测定浓度的50％、100％、150％的浓度水平溶液作为回收率试验溶液。按实施例1方法进样测定。结果见表13和表14
[0103]
表13莫诺苷含量回收率测试结果
[0104][0105]
表14马钱苷含量回收率测试结果
[0106][0107]
莫诺苷平均回收率为98.79％，rsd为1.19％，马钱苷平均回收率为99.03％，rsd为1.11％，符合要求。
[0108]
实验例2.8耐用性试验
[0109]
考察色谱条件发生微小变动(温度
±
2％，磷酸浓度
±
0.05％，流速
±
0.2％，波长
±
2nm，不同色谱柱)时，检测方法的耐受程度。结果见表15
[0110]
表15耐用性测试结果
[0111][0112]
在不同条件下，供试品溶液各指标成分含量结果与正常条件相比相对含量均在95.0～105.0％之间，表明本方法在流速、波长、不同酸浓度及不同色谱柱型号等条件变化时，耐用性良好。
[0113]
对比实验例
[0114]
为直观说明本发明的创新效果，以下对比实验例是采用《中国药典》2020年版山茱萸项下方法，对山茱萸、酒萸肉的通用性评价，所得hplc色谱图见图8、图9、图10、图11。
[0115]
药典方法：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为240nm；柱温为35℃。理论板数按马钱苷峰计算应不低于10000；洗脱梯度为：0-20min，流动相a的体积分数为7％；20-50min，流动相a的体积分数由7％变至20％；
[0116]
对照品溶液的制备取莫诺苷对照品、马钱苷对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每lml各含50μg的混合溶液,即得；
[0117]
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0118]
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0119]
本发明建立的山茱萸中含量测定方法与现有药典方法相比，实现的色谱峰的良好分离，色谱峰型较好，峰干扰少，且基线平稳，方法通用性更强。