一种顶空固相微萃取-气相色谱质谱检测分析方法与流程

1.本发明属于分析化学领域，具体涉及一种顶空固相微萃取-气相色谱质谱检测分析方法。


背景技术：

2.固相微萃取技术基于采用涂有固定相的熔融石英纤维来吸附、富集样品中的待测物质。在将顶空固相微萃取模式用于风味油脂的分析过程中，萃取过程可以一般分为两个步骤：第一步包括被分析组分从油相中先扩散到气相中；第二步包括被分析组分从气相转移到萃取固定相中。这种方法可以避免萃取固定相受到样品基质中高分子物质和非挥发性物质(如甘油三酯、磷脂、糖脂和甾醇酯等)污染。然而，在萃取过程中，风味物质挥发性化合物含量的不同导致顶空瓶上方的压力不一致；受不同工艺下获得的油脂的极性、粘度和表面张力等因素的影响，不同挥发性化合物在不同油脂中存在释放不统一的情况；另外，大量挥发性风味物质的释放由于固相微萃取纤维头的不同材质而存在竞争吸附现象，使得挥发性物质的吸附也存在选择性。因此，多方面的因素导致了具有不同基质和不同风味物质分布和浓度的样品在萃取过程中存在萃取不均一的情形，进而导致了由此获得的定量分析结果存在很大的偏差，并且重现性差。
3.因此，本领域需要一种能够降低或消除上述定量分析结果的偏差的分析方法，从而可以针对不同的油脂样品进行更加准确的定量分析。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种定量分析风味油脂中的挥发性风味物质的方法，尤其是一种连续分析数学多米诺模型外标法定量分析风味油脂中的挥发性风味物质的方法，该方法能够降低或消除现有技术针对不同油脂样品进行定量分析时由于各种因素导致的偏差。
5.因此，本发明提供了一种顶空固相微萃取-气相色谱质谱定性和定量检测方法，包括以下步骤：
6.1)选定内标物：根据待测样品中已知风味物质组分，选定内标物；
7.2)配制标准溶液：将步骤1)选定的内标物配制成混合内标溶液；
8.3)将混合内标溶液和待测样品混合，将混合液置于顶空瓶中，进行孵化-萃取处理，获得萃取物；
9.4)将步骤3)所得萃取物移入气相色谱质谱仪进行脱附，并对样品进行分析检测，获得待测样品中每种风味物质组分峰的保留时间、峰面积以及内标物峰面积；
10.5)将内标物和待测样品风味物质组分标准品混合，配制成内标稀释液；
11.6)将内标稀释液用气相色谱质谱仪进行分析检测，获得风味物质标准品峰的保留时间、峰面积和内标物峰面积；
12.7)对比步骤6)和步骤4)中所述的保留时间确定待检测样品中的风味物质，进一步
用峰面积通过多米诺分析数学模型拟合计算得出待检测样品中各种风味物质的浓度。
13.根据本发明的实施方案，所述方法包括以下步骤：
14.1)选定内标物：将待检测样品中性质相近、无相互作用的风味物质进行分组，并为每组风味物质选择一个内标物；所述内标物与风味物质的物化性质相似，但不存在于待检测样品中；
15.2)配制标准溶液：将步骤1)选定的内标物加入到油模拟溶剂中，配制混合内标溶液；
16.3)将步骤2)中所述混合内标溶液加入到待检测样品中，含有混合内标的待检测样品进行孵化-萃取处理，获得萃取物；
17.4)将步骤3)所得萃取物移入气相色谱质谱仪进行脱附后，取样通过气相色谱质谱联用仪(gc/ms)连续多次对样品进行分析检测，获得待测样品中每种风味物质组分峰的保留时间、峰面积以及内标物峰面积；
18.5)将所述每组风味物质的标准品和该组的内标物溶于挥发性有机溶剂，配制得到浓度为1000～5000mg/l的内标储备液；进一步用挥发性溶剂稀释到1-500mg/l，得到内标稀释液；
19.6)使用气相色谱质谱联用仪液相进样步骤5)中的内标稀释液，得到每种风味物质组分峰的保留时间、峰面积和其所属组内标的峰面积；
20.7)对比步骤6)和步骤4)中所述的保留时间获得待检测样品中的风味物质类型，进一步对峰面积通过多米诺分析数学模型拟合计算得出待检测样品中各种风味物质的浓度。
21.根据本发明的实施方案，步骤1)所述待检测样品可以为油脂，优选植物油，更优选在常温时为液态的油脂，例如为菜籽油、花生油或芝麻油；根据本发明示例性的实施方案，步骤1)所述分组为：第一组为醛、酮、醇、硫醇等(有氧化还原性)；第二组为硫甙降解产物、腈类；第三组为杂环类物质，如吡嗪类、噻吩、吡啶等(因含有n原子，有碱性)；第四组为酸性物质。
22.具体地，第一组包括：己醛，2-辛醛，苯甲醛，2,4-庚二烯醛，2-呋喃甲醇，2-壬醛，2,4-壬二烯醛，呋喃酮，二甲基二硫，二甲基三硫等，以2-甲基-3-庚酮作为内标；第二组包括：2-丁烯腈，3-戊烯腈，5-己烯腈，2,4-己二烯腈，1-丁烯异硫氰酸酯，苯丙腈，以叔丁基异硫氰酸酯作为内标；第三组包括：甲基吡嗪，2,5-二甲基吡嗪，2,6-二甲基吡嗪，乙基吡嗪，2-乙基-6-甲基吡嗪，2-乙基-5-甲基吡嗪，三甲基吡嗪，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪，2-甲基-3,5-二乙基吡嗪等，以3-甲基吡啶作为内标；第四组包括：乙酸，2-甲基丁酸，戊酸，苯乙酸，己酸，愈创木酚，2-甲氧基苯酚等，以2-己烯酸作为内标。
23.根据本发明的实施方案，步骤2)中，所述油模拟溶剂可以为辛酸癸酸甘油三酯、三辛酸甘油三酯和三癸酸甘油三酯中的至少一种。所述油模拟溶剂与油脂的极性和性质接近，可以作为油脂的替代基质，使得目标化合物溶解具有与实际样品相类似的溶解性、弱相互作用和挥发性。
24.根据本发明的实施方案，步骤2)中，所述混合内标溶液中步骤1)选定的不同内标物一致，内标物也可选择其他与目标化合物性质相近但样品中不含有的其他化合物，各内标物的浓度可以为20-500mg/kg，例如为50-200mg/kg，示例性为100mg/kg；
25.根据本发明的实施方案，步骤2)中，优选所述混合内标溶液中任意一种内标的重
量可以为其它待测目标物总重量的1/3～3倍。
26.根据本发明的实施方案，步骤3)中所述孵化在保证能够得到线性曲线的前提下，称取合适样品量的待测样品加入顶空瓶中进行孵化；所述萃取是向顶空瓶中插入固相微萃取装置的萃取头进行吸附。
27.根据本发明的实施方案，步骤4)中所述对样品进行分析检测，包括对脱附样品进行色谱分析，记录进样次数x，以及每次进样分析所得的每个风味物质组分特征峰各自的峰面积a
x；
重复萃取-脱附-分析检测步骤，重复次数为2-10次。
28.根据本发明的实施方案，在步骤5)中，所述挥发性溶剂可以为醚类溶剂，例如为乙醚、石油醚、甲基叔丁基醚、二异丙醚、甲基乙基醚、四氢呋喃、乙二醇二甲醚等；醇类溶剂，例如为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇；酮类溶剂，例如为丙酮、丁酮等；烃类溶剂，例如为戊烷、己烷、环己烷等；卤代溶剂，例如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳；以及乙酸乙酯、二硫化碳、乙腈等低沸点溶剂；优选为乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚或者甲醇中的至少一种；具有对目标物溶解能力且沸点较目标化合物低的溶剂，其挥发性高于风味物质的挥发性，因而可以抑制风味物质的挥发、防止取样时风味物质的损失以及防止不同类型风味物质的相互作用。
29.根据本发明的实施方案，在步骤5)中，所述内标稀释液的浓度可以为1500-4500mg/l，例如为2000-4000mg/l，示例性为2500mg/l、3000mg/l、3500mg/l；
30.根据本发明的实施方案，在步骤5)中，所述挥发性溶剂的挥发性强于风味物质的挥发性，因而可以优先占据顶空、抑制标准品的挥发，使得标准品存在于液相溶剂中。
31.根据本发明示例性的实施方案，步骤6)的具体步骤包括：
32.(a)待测样品孵化：在保证能够得到线性曲线的前提下，称取合适样品量的待测样品加入顶空瓶中，进行孵化。不同风味油脂的称取量可以不同，例如食用菜籽油称取0.1-1g加入20ml顶空瓶，80℃孵化20min；再如，浓香菜籽油称取0.05g加入20ml顶空瓶。
33.(b)萃取：向顶空瓶中插入固相微萃取装置的萃取头进行吸附(吸附也可称为萃取)；吸附条件例如为50℃吸附50min；
34.(c)脱附：萃取完成后将纤维头移出，然后插入气相色谱质谱联用仪(gc-ms)的进样口，使萃取物完全脱附。例如，脱附条件为：脱附时间1-4min，优选80s；
35.(d)进行gc/ms分析：对脱附样品进行色谱分析，记录进样次数x，以及每次进样分析所得的每个风味物质特征离子峰各自的峰面积a
x
。由于样品中风味物质可能有多个，因此所对应的特征峰也有多个，需要分别记录每个风味物质特征峰的峰面积。
36.优选地，gc条件包括：hp-ffap毛细管柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；采用不分流方式进样，进样口温度250℃；程序升温条件为起始温度40℃，保持1.5min，以10℃/min的速率升温至100℃，保持5min；以2℃/min的速率升温至150℃，保持10min；以5℃/min的速率升温至185℃；以20℃/min的速率升温至245℃，保持8min；总分析时间65.5min。载气为氦气，流速1.0ml/min。
37.优选地，ms条件包括：离子源温度230℃，四级杆温度150℃，辅助加热区温度280℃；电离方式为电子轰击(ei)，电子能量70ev，采用全扫描采集模式，质量扫描范围为35-500u，对已有标准品化合物根据质谱nist.l数据库对目标化合物进行选择离子扫描。
38.(e)重复进样分析，对待测样品按照(a)(b)(c)(d)条件进行孵化、萃取和脱附的方
式进行重复进样分析，重复的次数可以为2-8次，例如4次。
39.根据本发明的实施方案，步骤7)中，所述多米诺分析数学模型包括以下步骤：1.以实际进样n次的峰面积取以e为底的自然对数为y，进样次数n为x，建立公式为y＝ax+b的线性数学模型；
40.2.通过计算满足条件线性相关系数r2》0.75，线性斜率a的绝对值大于0.4即可计算，对于不满足此条件的风味物质而言，可以调整步骤孵化-萃取-脱附过程中的萃取条件如孵化萃取温度时间和称样量进行重新计算。
41.3分别计算各风味物质总峰面积结果为a＝a1/(1-exp(a))，其中a1为第一次进样色谱峰的面积，a为线性斜率。
42.4按照以上方法依次计算混合液中内标物总峰面积a
isd
43.5计算内标稀释液中风味物质标准品总峰面积计a
l
和内标物总峰面积a
isdl
44.6计算目标样品的浓度c＝c
isd
×a×aisdl
×cl
/(a
isd
×al
×cisdl
)。
45.其中，c
isd
：混合内标溶液内标物浓度；a：风味物质拟合后总峰面积；
46.a
isdl
：内标物总峰面积；
47.c
l
：内标稀释液中标准品浓度；
48.a
isd
：混合液中内标物总峰面积；
49.a
l
：内标稀释液中风味物质标准品总峰面积；
50.c
isdl
：内标稀释液中内标物浓度。
51.有益效果
52.1.根据本发明通过多次连续采集进样的分析方法，通过建立数学模型实现了待测化合物全部萃取进样结果的模拟，校正了多种因素导致的萃取偏差，并且多米诺分析数学模型内标法定量风味物质的方法可以对基质复杂和风味化合物含量高的不同油脂样品进行更加准确的定量。
53.2.对于浓香风味油脂中关键风味挥发物的检测，传统方法采用的是内标半定量的分析方法；这样的分析方法误差较大，稳定性不好，主要的原因在于例如浓香菜籽油中的风味化合物含量较高，风味化合物的释放导致顶空瓶压力太大，风味化合物不能有效的释放出来，并且油脂对风味化合物有一定的吸附作用，同时不同基质对不同风味化合物的保留和释放效果不同。
54.3.根据本发明的检测能有效地克服基质干扰的影响，减少每次在顶空萃取中挥发量的不一致而带来的对分析结果一致性的不利影响。
55.4.本发明使用了标准品作为参照物定量关键风味化合物的含量；由于不同种类风味化合物彼此之间存在干扰，根据本发明采用多组内标混标液可以有效克服不同风味化合物的相互之间的影响。
56.5.本发明首次使用液体进样的结果来校正spme进样的结果，内标化合物的选择以及采用多次spme进样保证了所有风味化合物进样的无差别性，进一步保证了结果的准确性。
具体实施方式
57.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，
下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
58.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
59.实验材料及耗材
60.设备：气相色谱质谱联用仪、多功能固相微萃取进样器、电子天平。
61.气相色谱条件
62.gc条件：hp-ffap毛细管柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；采用不分流方式进样，进样口温度250℃；程序升温条件为起始温度40℃，保持1.5min，以10℃/min的速率升温至100℃，保持5min；以2℃/min的速率升温至150℃，保持10min；以5℃/min的速率升温至185℃；以20℃/min的速率升温至245℃，保持8min；总分析时间65.5min。载气为氦气，流速1.0ml/min。
63.ms条件：离子源温度230℃，四级杆温度150℃，辅助加热区温度280℃；电离方式为电子轰击(ei)，电子能量70ev，采用全扫描采集模式，质量扫描范围为35-500u，对已有标准品化合物根据质谱nist.l数据库对目标化合物进行选择离子扫描。
64.实施例1：分析浓香菜籽油，花生油和芝麻油中的吡嗪化合物的含量
65.称取5.0g风味油脂样品，向其中加入100mg/kg的3-甲基吡啶125mg溶于辛酸癸酸甘油三酯中的混合内标溶液，以250rpm震荡30min混合均匀，称取0.1-1g的混合均匀样品油于20ml顶空瓶中，80℃孵化20min，自动向顶空瓶中插入固相微萃取装置的萃取头，推出纤维头进行吸附，吸附条件为50℃吸附50min，脱附时间80s，gcms分析并记录数据。以此分析方法对此样品中的待测化合物及内标按照以上条件再次gcms分析2到4次，并记录各化合物峰面积。
66.分别称取20mg内标3-甲基吡啶及13种吡嗪化合物甲基吡嗪，2,5-二甲基吡嗪，2,6-二甲基吡嗪，乙基吡嗪，2-乙基-6-甲基吡嗪，2-乙基-5-甲基吡嗪，三甲基吡嗪，2,6-二乙基吡嗪，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，3,5-二乙基-2-甲基吡嗪，异丙基吡嗪，5h-5-甲基-6,7-二氢环戊并吡嗪，并加入10ml乙酸乙酯中，配制2000mg/kg储备液溶液；用乙酸乙酯将此储备液稀释至25mg/kg进gcms分析，分别记录各化合物的峰面积。
67.表1三种风味油脂中的13种吡嗪化合物含量结果
[0068][0069]
对这些样品分别取三次平行结果。
[0070]
表2三种风味油脂中13种吡嗪化合物线性拟合及斜率结果
[0071][0072][0073]
从结果可以看出13种吡嗪化合物拟合线性相关系数r2》0.75，线性斜率a的绝对值
大于0.4。
[0074]
实施例2：分析浓香菜籽油中醛酮醇化合物的含量
[0075]
称取5.0g风味油脂样品，向其中加入100mg/kg的混合内标溶液2-甲基-3-庚酮125mg，以250rpm震荡搅拌30min混合均匀，称取0.1-1g的混合均匀样品于20ml顶空瓶中，80℃孵化20min，自动向顶空瓶中插入固相微萃取装置的萃取头，推出纤维头进行吸附，吸附条件为50℃吸附50min。然后将纤维头移出，并且插入气相色谱质谱联用仪进样口进行脱附，脱附时间80s，gcms分析并记录数据。以此分析方法对此样品中的待测化合物及内标按照以上条件进行数据分析2到4次，并记录各化合物峰面积。
[0076]
分别称取20mg内标2-甲基-3-庚酮及13种醇醛酮类风味化合物己醛，1-辛烯-3-酮，2-辛烯醛，1-辛烯-3-醇，糠醛，苯甲醛，苯乙醛，2-壬烯醛，1-辛醇，5-甲基糠醛，2-糠醇，2,4-壬二烯醛，2,4-癸二烯醛，加入10ml乙醚中，配制2000mg/kg储备液溶液，用乙醚将此储备液稀释至25mg/kg进行gcms分析，分别记录各化合物的峰面积。
[0077]
表3浓香菜籽油13种醇醛酮类化合物含量及线性拟合结果
[0078][0079]
样品取三次平行结果。
[0080]
从结果可以看出13种醇醛酮化合物拟合线性相关系数r2》0.75，线性斜率a的绝对值大于0.4。
[0081]
结果计算：
[0082]
定量分析是根据多次gc-ms目标化合物峰面积进行对数函数线性数据拟合，模拟计算每次顶空固相微萃取获得的目标化合物峰面积，根据数据拟合计算得到该目标化合物的总峰面积结果，使用此方法进行内标法计算结果。
[0083]
计算公式：
[0084]
1以实际进样n次的峰面积取以e为底的自然对数为y，进样次数n为x，建立公式为y＝ax+b的线性数学模型
[0085]
2通过计算满足条件线性相关系数r2》0.75，线性斜率a的绝对值大于0.4即可计
算，对于不满足此条件的化合物需要调整固相微萃取条件如孵化萃取温度时间和称样量进行重新计算。
[0086]
3分别计算各化合物总峰面积结果为a＝a1/(1-exp(a))，a1为第一次进样色谱峰的面积，a为斜率。
[0087]
4按照以上方法依次计算内标峰面积计为a
isd
[0088]
5计算液体进样标准品峰面积计为a
l
和内标峰面积a
isdl
[0089]
6计算目标样品的浓度c＝c
isd
×a×aisdl
×cl
/(a
isd
×al
×cisdl
)。
[0090]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。