检测血液中钾K、钠Na、钙Ca、镁Mg、铁Fe元素含量的方法与流程

检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法。


背景技术：

2.微量元素是维持人体正常新陈代谢和生命活动的重要物质，具有调节细胞膜的通透性和维持神经肌肉兴奋性的作用，也是反映人体营养状况的重要指标，元素的缺失和富集可以引起多种疾病。微量元素亦是人体组织的重要组成成分，如铁为血红蛋白的重要组成成分，钙、磷、镁为组成牙齿、骨骼的成分，在体内成为某些酶、激素和维生素等的组成部分，研究发现体内50％-70％的酶需要微量元素的参与或激活，如硒是人体内谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，铁参与血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及许多酶的合成。
3.人体元素分析涉及的生物检材有血液、尿液、头发、骨头和指甲等，其中最常用的是血液。由于血清中含有人体内多种微量元素，血清中元素浓度能够在很大程度上代表人体内元素水平，对其中微量元素含量的检测，在临床上具有重要意义，因此人血液中元素的浓度常作为重要的生物学指标。然而，随着微量元素与疾病关系的日益明确以及人们对健康问题的密切关注，准确、快速、方便的测定人体内微量元素的含量，成为微量元素检测领域急需解决的问题。人体体液中微量元素检测的主要难点在于某些元素的浓度很低，甚至达到ng/l-μg/l级别，而且基体复杂，给检测带来干扰，因此如何准确快速的进行多元素同时测定，是亟待解决的问题。
4.目前对于元素的检测方法有：原子吸收光谱法(atomic absorption spectrometry:aas)、原子发射光谱法(atomic emission spectrometry:aes)、原子荧光光谱法(atomic florescence spectrometry:afs)、紫外可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry:uvs)、电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry:icp-aes)、电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry:icp-ms)。
5.电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)使用icp焰炬作为仪器的原子化和离子化装置，将质谱作为检测手段，可对元素周期表中大部分元素进行测定，同时可以满足对测定灵敏度的要求。但由于电感耦合等离子体产生的高温几乎使所处环境下的所有原子和分子发生电离，由同量异位素、基体以及在高温、高压条件下发生化学反应而生成的分子离子引起的干扰问题始终困扰着icp-ms分析工作者。
6.钾(39k)、钙(44ca)、镁(24mg)和钠(23na)是低质量，低电离势元素，是环境中的常量元素，其分析通常受限于样品引入系统造成的污染。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中存在的问题，本发明拟采用电感耦合等离子体质谱“冷焰”模式即电感耦合“冷”等离子体质谱的方式同时测定钾k、钙ca、镁mg、钠na和铁fe元素的含量，
可以有效消除血清基体和ar基分子离子引起的干扰，实现人血清中钾k、钙ca、镁mg、钠na和铁fe元素含量的准确测定。本发明检测方法所需样品用量少，前处理简单，所用内标抗干扰能力强，与待测元素电离能相近，对目标元素的校正效果稳定；且该方法检测周期短，准确度和精密度高，适合于高通量样本的检测。
8.本发明提供一种电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其中，冷等离子体系统中，rf功率为800-900w。
9.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其冷等离子体系统中，雾化气流量为0.85-1.02l/min、载气流量为0.7-0.9l/min、冷却气流量为13-15l/min，以上气体均为氩气；
10.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其冷等离子体系统中，雾化气流量为0.91l/min、载气流量为0.8l/min、冷却气流量为14l/min，以上气体均为氩气；
11.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其冷等离子体系统中，he气作为碰撞气，流量为4.5-6.5ml/min，优选为5.0ml/min。
12.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其方法包括：使用氩气经电离形成等离子体，氩气形成的等离子体对待测血液样本进行电离，离子通过四级杆质谱对不同m/z的元素进行区分，最终不同m/z的元素通过检测器进行检测。
13.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe的标准工作液由含有5种元素标准储备液稀释得到，其中，钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe的标准工作液中各元素的线性范围为：钾k和钠na元素线性范围为2.5-400mg/l，钙ca和镁mg元素线性范围为0.125-20mg/l，铁fe元素线性范围为2.5-400μg/l；
14.可选地，钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe的标准工作液由含有5种元素标准储备液稀释得到：其中，钾k、钠na标准曲线浓度分别为2.5、5、10、20、100、200、400mg/l，钙ca、镁mg标准曲线浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、5、10、20mg/l，铁fe标准曲线浓度分别为2.5、5、10、20、100、200、400μg/l。
15.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法中，配制标准工作液所用的稀释液为：0.1％-10％，优选为2％(v/v)硝酸溶液。
16.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其特征在于，采用含有钪sc、锗ge、铑rh、铟in四种元素的溶液作为内标液；
17.可选地，所述内标液中，钪sc、锗ge、铑rh、铟in四种元素的浓度分别为50-100μg/ml、50-100μg/ml、5-50μg/ml、50-100μg/ml；
18.可选地，所述各内标元素质量数为钪45sc、锗73ge、铑103rh、铟115in；
19.可选地，配制内标液所用的稀释液为0.1％-10％的硝酸溶液。
20.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中
钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其特征在于，待测血液样本的处理方法包括：
21.(a)待测血液样本离心后得到血清，血清冷冻条件下保存；
22.(b)取步骤(a)血清样本置于聚四氟乙烯消解罐中，加入浓硝酸和过氧化氢，进行微波消解；消解结束后，血清样本用超纯水定容至；
23.可选地，步骤(a)中，离心速度为3500r/min，离心时间为10min；
24.可选地，步骤(b)中，加入100-200μl浓硝酸、250-500μl过氧化氢；优选，加入200μl浓硝酸、500μl过氧化氢。
25.可选地，本发明所述的电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其特征在于：各待测元素质量数为：钾39k、钠23na、钙44ca、镁24mg、铁57fe。
26.可选地，本发明所述电感耦合“冷”等离子体质谱(icp-ms)系统定量检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量的方法，其包括以下步骤：
27.(一)标准工作液的标定
28.(a)钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe的标准工作液含有5种元素标准储备液稀释得到，由此得到7管独立的标准溶液混合液，每管均含有5种元素，另设1管稀释液作为空白管。其中，元素钾k、钠na标准曲线的浓度分别为2.5、5、10、20、100、200、400mg/l；元素钙ca、镁mg标准曲线的浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、5、10、20mg/l；元素铁fe标准曲线的浓度分别为2.5、5、10、20、100、200、400μg/l；
29.(b)配制内标储备液
30.采用含有钪sc、锗ge、铑rh、铟in四种元素的溶液作为内标液，配制成钪sc、锗ge、铑rh、铟in四种元素浓度分别为50μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、50μg/ml的内标储备液；
31.(c)拟合标准曲线方程
32.在下述电感耦合“冷”等离子体质谱条件下：rf功率为800-900w、雾化气流量为0.85-1.02l/min、载气流量为0.7-0.9l/min、冷却气流量为13-15l/min，以上气体均为氩气；he气作为碰撞气，流量为4.5-6.5ml/min；通过四级杆质谱对不同m/z的元素进行区分；仪器根据7点标准溶液自动建立标准曲线，根据标准工作溶液中各元素信号和内标元素信号的比值和各元素标准工作浓度与内标浓度的比值绘制标准曲线，标准曲线满足r2＞0.9900，利用样品中待测元素信号和内标信号的比值定量样品中待测元素的含量；
33.(二)待测血液样本的处理
34.(a)将待测血液样本在离心速度3500r/min下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
35.(b)取步骤(a)血清样本置于聚四氟乙烯消解罐中，加入100-200μl浓硝酸和250-500μl过氧化氢，进行微波消解；消解结束后，血清样本用超纯水定容；
36.(三)待测血液样本的检测
37.使用电感耦合“冷”等离子体质谱仪对上述处理好的样品进行检测，将钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe面积与其内标面积之比代入上述步骤的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe与其内标浓度比，标准内标液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe是已知的，通过计算得到待检测血液中的钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe的浓度。
38.可选地，本发明的检测血液中钾、钠、钙、镁、铁元素含量的方法，样本准备过程中
所使用的试管(优选聚丙烯)和消解罐均采用10％硝酸浸泡过夜，并用超纯水清洗3遍待用。
39.本发明具有如下有益效果：
40.1、建立了一种适用于电感耦合“冷”等离子体质谱icp-ms检测血清中微量元素的灵敏、特异的方法，受血清中其他成分的干扰较少，运行成本较正常等离子体条件低。
41.2、检出限低：本发明在电感耦合“冷”等离子体质谱icp-ms检测平台，各元素定量检出限在ng/l-μg/l级别。
42.3、专属性强：电感耦合“冷”等离子体质谱icp-ms检测采用的是“冷焰”形式，可以有效消除血清基体和ar基分子离子引起的干扰，实现人血清中钾k、钙ca、镁mg、钠na和铁fe元素含量的准确测定。
43.4、简便安全：样品前处理简单、操作简单安全、谱图解析及数据统计对人员要求低。
44.5、快速：质量扫描快速，分析速度快，运行周期短，可实现批量处理，可在1分钟内完成1个样本的5种元素的检测。
45.原理与定义
46.术语“icp-ms”是将电感耦合等离子体作为离子源的一种无机多元素分析技术，通常情况下，氩气流由高能的射频能量激发形成等离子体，而被检测的样品通过水溶液的气溶胶的形式进入等离子体中，进行去溶剂化、汽化解离和电离。部分等离子体进入真空系统中，其中的正离子被按照质荷比进行分离。电感耦合等离子体质谱通常情况下是由样品引入系统、离子源、接口部分、离子聚焦系统、质量分析器、检测系统这几部分组成，此外，仪器中还配备真空系统、供电系统以及用于仪器控制与数据处理的计算机系统。
附图说明
47.图1是本发明实施例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(k)的标准曲线图。
48.图2是本发明实施例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钠(na)的标准曲线图。
49.图3是本发明实施例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钙(ca)的标准曲线图。
50.图4是本发明实施例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中镁(mg)的标准曲线图。
51.图5是本发明实施例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中铁(fe)的标准曲线图。
52.图6是本发明实施例2电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(k)的标准曲线图。
53.图7是本发明实施例2电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(na)的标准曲线图。
54.图8是本发明实施例2电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(ca)的标准曲线图。
55.图9是本发明实施例2电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方
法中钾(mg)的标准曲线图。
56.图10是本发明实施例2电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(fe)的标准曲线图。
57.图11是本发明实施例3电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(k)的标准曲线图。
58.图12是本发明实施例3电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(na)的标准曲线图。
59.图13是本发明实施例3电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(ca)的标准曲线图。
60.图14是本发明实施例3电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(mg)的标准曲线图。
61.图15是本发明实施例3电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(fe)的标准曲线图。
62.图16是对比例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(k)的标准曲线图。
63.图17是对比例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(na)的标准曲线图。
64.图18是对比例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(ca)的标准曲线图。
65.图19是对比例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(mg)的标准曲线图。
66.图20是对比例1电感耦合“冷”等离子体质谱法测定人体血清中微量元素方法中钾(fe)的标准曲线图。
具体实施方式
67.为了更好地说明本发明，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
68.实施例1
69.(一)标准溶液的标定
70.实验所用超纯水由comfort超纯水仪制备(sartorius公司，德国)，硝酸(fisher公司，电子级，纯度≥65％，美国)，过氧化氢(merck公司，超纯级，美国)。实验所用单标液(1000mg/l，国家有色金属及电子材料分析测试中心，中国)。
71.(a)配制微量元素的标准溶液储备液
72.将铁fe的单元素标准液稀释成浓度为10mg/l，得到标准溶液储备液stock solution 1；
73.准备钾k、钠na、钙ca、镁mg单元素标溶液浓度均为1000mg/l；
74.(b)配制7点标准曲线的标准工作液
75.分别从stock solution 1、钾k、钠na、钙ca、镁mg单标溶液中取320μl、3.2ml、3.2ml、160μl、160μl，并用稀释液补足至8ml配制成std7；从std7稀释得到std6、std5、std4、
std3、std2、std1(稀释方式如表1所示)；对于元素钾k、钠na标准曲线的浓度分别为2.5、5、10、20、100、200、400mg/l；对于元素钙ca、镁mg标准曲线的浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、5、10、20mg/l；对于元素铁fe标准曲线的浓度分别为2.5、5、10、20、100、200、400μg/l；由此得到7管独立的标准溶液混合液(各元素的浓度如表2所示)，每管均含有5种元素，另设1管稀释液作为空白管(std0)；
76.表1
[0077][0078][0079]
表2标准溶液中各元素的最终浓度
[0080]
元素std0std1std2std3std4std5std6std7单位k,na02.551020100200400mg/lca,mg00.1250.250.5151020mg/lfe02.551020100200400μg/l
[0081]
(d)配制稀释液
[0082]
将浓硝酸10ml，加入超纯水定容至500ml，混匀即得稀释液2％(v/v)硝酸溶液；
[0083]
(e)配制内标储备液
[0084]
将内标元素钪、锗、铑、铟四种元素的单标液加硝酸和超纯水配制成浓度分别为50μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、50μg/ml，得到内标储备液，其中四种单元素标准液或单标液起始浓度均为1000mg/l；
[0085]
(f)血清质控品前处理
[0086]
血清质控品即为已知浓度标准样本(来源：seronorm公司，trace elements serum l-1，6
×
3ml，挪威)，靶值为39k(127mg/l)、23na(2917mg/l)、44ca(86mg/l)、24mg(16.8mg/l)、57fe(1.47mg/l)。
[0087]
取已知浓度标准样本，室温解冻30min，用3ml超纯水溶解，混匀20min，得到血清质控品，在-20℃条件下保存；
[0088]
(g)拟合标准曲线方程
[0089]
在下述表4电感耦合“冷”等离子体质谱条件下：通过四级杆质谱对不同m/z的元素进行区分；仪器根据7点标准溶液自动建立标准曲线，根据标准工作溶液中各元素信号和内标元素信号的比值和各元素标准工作浓度与内标浓度的比值绘制标准曲线，标准曲线满足
r2＞0.9900，利用样品中待测元素信号和内标信号的比值定量样品中待测元素的含量。
[0090]
(二)待测血液样本的处理
[0091]
(a)使用bd红帽无添加物采血管(货号367814)，静脉采血2ml；
[0092]
(b)将血液样本静置30min后，在离心速度3500r/min下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
[0093]
(c)取100μl上层血清样本置于聚四氟乙烯消解罐中，加入200μl浓硝酸和500μl过氧化氢，进行微波消解；消解结束后，血清样本用超纯水定容至5ml(微波消解程序见表3)；
[0094]
(d)取3例100μl血清质控品置于聚四氟乙烯消解罐中，加入200μl浓硝酸和500μl过氧化氢，进行微波消解；消解结束后，血清样本用超纯水定容至5ml(微波消解程序见表3)。
[0095]
表3血清样品微波消解参数
[0096][0097]
(三)待测血液样本的检测
[0098]
使用电感耦合“冷”等离子体质谱仪对上述处理好的空白溶剂、血清质控品和待测血液样本进行检测，将钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe面积与其内标面积之比代入上述步骤(g)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe与其内标浓度比，标准内标液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe是已知的，通过计算得到待检测血液中的钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe的浓度。
[0099]
(a)仪器及工作参数
[0100]
本文采用thermo icap-tq仪器(赛默飞公司，美国)进行元素分析，仪器配备360个样本的cetac自动进样器，仪器的基本参数设置如表4所示。
[0101]
表4赛默飞icap-tq仪器参数设置
[0102][0103]
(四)仪器检出限
[0104]
根据上述所列的仪器条件和方法，空白溶液为2％硝酸，连续测量11次空白溶液，4
个平行样本，以其3倍标准偏差作为该方法的检出限。结果见表5。
[0105]
表5仪器检出限
[0106][0107]
说明在该测量条件下，有非常好的抑制背景干扰的能力。
[0108]
(五)血清质控品分析
[0109]
根据上述所列的仪器条件和方法，对血清质控品进行了测定，测定结果的准确度和精密度如下表6：
[0110]
表6血清质控品检测结果
[0111][0112][0113]
对于血清质控品中的各元素，其检出限均在标准值范围内，精密度在4％范围内，即本发明对于各元素的检测真实可信。
[0114]
实施例2
[0115]
重复实施实施例1的检测方法，所不同的是，冷等离子体系统中，rf功率为800w，检测结果如图6～图10所示，检出限、准确度和精密度等各项技术指标均符合要求。
[0116]
实施例3
[0117]
重复实施实施例1的检测方法，所不同的是，冷等离子体系统中，rf功率为900w，检测结果如图11～图15所示，检出限、准确度和精密度等各项技术指标均符合要求。
[0118]
对比例1
[0119]
重复实施实施例1的检测方法，所不同的是，冷等离子体系统中，rf功率为750w，检测结果如图16～图20所示，ca元素线性较差，检出限不能达到要求，并且钾k、钠na、镁mg、铁fe元素精密度差。
[0120]
综上实施例及对比例的检测结果可以看出：本发明检测血液中钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe元素含量方法的，降低了多原子离子的干扰的同时可获得较好的检出限，使钾k、钠na、钙ca、镁mg、铁fe这5种元素在较宽的线性范围内得到较好的线性，检出限、准确度和精密度等各项技术指标均符合要求，且重现性良好，提高了检测结果的准确度。
[0121]
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。