一种铁蛋白检测试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明属于医疗检测中的体外诊断领域，具体涉及一种铁蛋白检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.铁蛋白是一种广泛存在于生物体内的一种储铁蛋白，分子量约450kda，具水合氧化铁内核和围绕内核而成的蛋白质外壳，其外壳由24个亚基组成，每个亚基约含163个氨基酸残基。做为机体内铁的主要储存形式，机体铁蛋白含量水平与机体铁储存量成正相关，机体铁蛋白因此也成为医学检验中最常应用于评价体内铁储存状况及诊断缺铁性贫血的一个重要生物标志物。
3.铁蛋白广泛存在于肝、脾、肾和骨髓内，尤以肝脏和脾脏为多。不同的检验方法确定的正常参考值有所差别，通常成年男性体内铁蛋白的正常参考值约在 15-280ng/ml，成年女性体内铁蛋白的正常参考值约在10-150ng/ml，体内铁蛋白水平在贫血或妊娠期会降低，临床上可通过检测铁蛋白含量甄别出机体铁储备水平，从而在缺铁的早期阶段能尽早采取相应措施预防缺铁性贫血的发生。当肝脏发生炎症，体内铁蛋白代谢就会发生障碍，铁蛋白含量随之发生变化，而且干细胞损伤越严重，体内铁蛋白含量越高。国内报道肝癌患者阳性率高达90％，肝癌患者治疗有效者体内铁蛋白下降，而恶化和再发者升高，持续增高则预后不良，另外当机体患肺癌、胰腺癌或白血病时，癌细胞合成的铁蛋白增多，可见做为一种非特异的肿瘤标志物及疗效监测手段之一，铁蛋白含量的临床监测具有重要意义。
4.目前，临床定量检测铁蛋白的方法主要有酶联免疫法、层析法、化学发光法和胶乳比浊法。酶联免疫法灵敏度高但操作繁琐，耗时较久，应用场景有限；层析法检测较快，但重复性差；化学发光法检测速度快，通量大，灵敏度高，但检测成本高，且各公司产品平台独立性强，技术及产品有各自壁垒；胶乳比浊法各公司技术平台可以兼容，操作简单，稳定性和重复性都较好，且适配仪器广泛应用在各级医疗机构，有广泛的应用场景；但现用胶乳比浊技术又受限于原料供应(需用多克隆抗体或者前处理后的单克隆抗体)，且工艺过程需多次离心操作，重悬离心沉淀时又有表面活性剂或蛋白的影响而易造成较大的批间差，因此工艺繁琐，批间差不易控。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种工艺简单，原料适用广，批间差小且易控的铁蛋白检测试剂盒及其制备方法。
6.本发明目的可通过下述技术方案实现：一种铁蛋白检测试剂盒，包括第一试剂、第二试剂及铁蛋白校准品；
7.所述第一试剂包括：第一溶液及第一防腐剂；
8.所述第二试剂包括：第二溶液、第二防腐剂及偶联抗人铁蛋白抗体的胶乳微球；
9.所述抗人铁蛋白抗体可以是抗人铁蛋白单克隆抗体或抗人铁蛋白多克隆抗体；
10.作为优选，所述第一试剂中的第一溶液的成分为：甘氨酸50-100mm，氯化钠1.8％-4.5％，蛋白保护剂0.5％-2.0％，牛血清白蛋白0.25％-2.0％，表面活性剂 0.05％-0.5％，ph 7.5-8.0；所述第一防腐剂选自叠氮钠、proclin系列中的至少一种，优选proclin 300，浓度为0.1％-0.5％；
11.作为又一优选，所述第二试剂中的第二溶液的成分为：mes 12.5mm，甘氨酸50-100mm，牛血清白蛋白0.5％-1.5％，蛋白保护剂2.0％-4.0％；
12.所述第二防腐剂选自叠氮钠、proclin系列中的至少一种，优选proclin 300，浓度为0.1％-0.5％；
13.所述胶乳微球为羧基修饰的聚苯乙烯微球，微球粒径为200-350nm，优选 300nm，浓度为0.1％-0.2％。
14.进一步地，所述铁蛋白校准品为用校准品稀释液将铁蛋白稀释至 0-1000ng/ml；
15.更进一步地，所述校准品稀释液的成分为：hepes 25-50mm，氯化钠 0.9％-2.7％，表面活性剂0.5％-1.0％，蛋白保护剂0.5％-1.0％，牛血清白蛋白 1.5％-3.0％，第三防腐剂；
16.所述蛋白保护剂选自蔗糖、海藻糖中的一种，优选海藻糖；
17.所述表面活性剂选自brij-35、tween 20、triton x100中的至少一种，优选triton x100；
18.所述第三防腐剂选自叠氮钠、proclin系列中的至少一种，优选proclin 300，浓度为0.1％-0.5％；
19.本发明还提供一种铁蛋白检测试剂盒的制备过程，包括以下步骤：
20.取胶乳微球溶于ph 6.5的25mm mes溶液中，加入edc搅拌后离心弃去上清，沉淀重悬并超声分散后加入抗人铁蛋白抗体，搅拌后加入保存液，超声分散后置于37℃10-16h即得。
21.作为优选，所述保存液的成分为：甘氨酸100-200mm，牛血清白蛋白 1.0％-3.0％，蛋白保护剂4.0％-8.0％，第二防腐剂0.2％-1.0％，ph 7.1。
22.进一步地，所述edc的用量按摩尔量计为取用胶乳微球表面羧基摩尔量的 15-35倍。
23.进一步地，所述离心的设置条件为9000rpm，10min。
24.进一步地，所述超声的设置条件为30％-40％功率，10min。
25.更进一步地，所述抗人铁蛋白抗体的用量按质量计为取用胶乳微球质量的 0.035-0.045倍。
26.上述制备过程仅需一次离心，重悬离心沉淀时没有表面活性剂或蛋白的影响，极大地方便操作，批间差小且易控；所用抗人铁蛋白抗体可使用单克隆抗体或多克隆抗体，且一株或多株使用均可，极大程度扩大了本发明的使用场景。
附图说明
27.图1为本发明实施例1试剂盒和对比例1试剂盒的相关性分析；
28.图2为实施例1试剂盒定标曲线和实施例2试剂盒的定标曲线对比。
具体实施方式
29.下述是本发明的具体实施方式，同时结合附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但下述实施例不应限制本发明的应用。
30.使用本发明试剂盒检测人铁蛋白含量的条件设置如下：
31.仪器使用日立7180全自动生化分析仪，检测波长为570nm，反应方向上升，校准方法为6点spline；
32.样本与第一试剂混合后孵育5min，加入第二试剂，18秒后取吸光值a1，反应5min后取吸光值a2，计算反应度
△
a＝a2-a1。以各校准品浓度为x轴，以各校准品测得的
△
a为y轴绘制定标曲线，检测待测样本时，将待测样本的
△
a代入定标曲线即可计算出待测样本中铁蛋白的浓度；
33.试剂比，第一试剂：第二试剂：样本＝150:50:10。
34.实施例1：
35.本实施例检测试剂盒由第一试剂，第二试剂及配用铁蛋白校准品组成；
36.其中，第一试剂的成分为：甘氨酸50mm，氯化钠1.8％，海藻糖0.5％，牛血清白蛋白0.5％，表面活性剂0.2％，proclin 300 0.2％，ph 7.5；
37.第二试剂的成分为：mes 12.5mm，甘氨酸50mm，牛血清白蛋白0.5％，海藻糖2.5％，proclin 300 0.2％，偶联抗人铁蛋白单克隆抗体的胶乳微球0.12％；
38.铁蛋白校准品的成分为：hepes 50mm，氯化钠0.9％，表面活性剂1.0％，海藻糖0.5％，牛血清白蛋白3.0％，proclin 300 0.2％，经校准品稀释液分别梯度稀释为20/50/250/500/1000ng/ml的重组铁蛋白抗原。
39.其中偶联抗人铁蛋白单克隆抗体的胶乳微球的制备过程如下：
40.取粒径为300nm、羧基活化的聚苯乙烯胶乳微球溶于ph 6.5的25mm mes 溶液中，胶乳微球的浓度为1.0％，加入胶乳微球羧基摩尔量35倍的edc，搅拌 30min后9000rpm离心10min弃去上清，使用ph 6.5的25mm mes溶液重悬沉淀至浓度为0.5％后35％功率超声10min分散，加入胶乳微球质量0.04倍的抗人铁蛋白单克隆抗体，搅拌2h后加入与前述重悬沉淀时mes溶液用量相同的保存液， 35％功率超声10min分散后置于37℃12h既得。
41.实施例2：
42.本实施例检测试剂盒由第一试剂，第二试剂及配用铁蛋白校准品组成；
43.其中，第一试剂的成分为：甘氨酸50mm，氯化钠0.9％，海藻糖0.5％，牛血清白蛋白0.5％，表面活性剂0.2％，proclin 300 0.2％，ph 7.5；
44.第二试剂的成分为：mes 12.5mm，甘氨酸50mm，牛血清白蛋白0.5％，海藻糖2.5％，proclin 300 0.2％，偶联抗人铁蛋白多克隆抗体的胶乳微球0.12％；
45.铁蛋白校准品的成分为：hepes 50mm，氯化钠0.9％，表面活性剂1.0％，海藻糖0.5％，牛血清白蛋白3.0％，proclin 300 0.2％，经校准品稀释液分别梯度稀释为20/50/250/500/1000ng/ml的重组铁蛋白抗原。
46.其中偶联抗人铁蛋白单克隆抗体的胶乳微球的制备过程如下：
47.取粒径为300nm、羧基活化的聚苯乙烯胶乳微球溶于ph 6.5的25mm mes 溶液中，胶乳微球的浓度为1.0％，加入胶乳微球羧基摩尔量35倍的edc，搅拌 30min后9000rpm离心10min弃去上清，使用ph 6.5的25mm mes溶液重悬沉淀至浓度为0.5％后35％功率超声
10min分散，加入胶乳微球质量0.04倍的抗人铁蛋白多克隆抗体，搅拌2h后加入与前述重悬沉淀时mes溶液用量相同的保存液， 35％功率超声10min分散后置于37℃12h既得。
48.实施例3：
49.本实施例检测试剂盒由第一试剂，第二试剂及配用铁蛋白校准品组成；
50.其中，第一试剂的成分为：甘氨酸100mm，氯化钠3.6％，海藻糖1.5％，牛血清白蛋白1.5％，表面活性剂0.5％，proclin 300 0.4％，ph 8.0；
51.第二试剂的成分为：mes 12.5mm，甘氨酸100mm，牛血清白蛋白1.5％，海藻糖3.5％，proclin 300 0.4％，偶联抗人铁蛋白多克隆抗体的胶乳微球0.2％；
52.铁蛋白校准品的成分为：hepes 25mm，氯化钠2.7％，表面活性剂1.0％，海藻糖1.0％，牛血清白蛋白2.0％，proclin 300 0.4％，经校准品稀释液分别梯度稀释为20/50/250/500/1000ng/ml的重组铁蛋白抗原。
53.其中偶联抗人铁蛋白单克隆抗体的胶乳微球的制备过程如下：
54.取粒径为250nm、羧基活化的聚苯乙烯胶乳微球溶于ph 6.5的25mm mes 溶液中，胶乳微球的浓度为1.0％，加入胶乳微球羧基摩尔量15倍的edc，搅拌 30min后9000rpm离心10min弃去上清，使用ph 6.5的25mm mes溶液重悬沉淀至浓度为0.5％后30％功率超声10min分散，加入胶乳微球质量0.045倍的抗人铁蛋白单克隆抗体，搅拌2h后加入与前述重悬沉淀时mes溶液用量相同的保存液， 30％功率超声10min分散后置于37℃15h既得。
55.对比例1：市售“铁蛋白检测试剂盒(胶乳比浊法)”。
56.将实施例1的试剂盒按本发明的测试方法进行定标，及对比例1的试剂盒按其说明书进行定标。后使用前述两种试剂盒检测相同的血清样本，以对比例1 试剂盒测得的浓度值为x轴，以实施例1试剂盒测得的浓度值为y轴做线性分析，其相关性如图1所示。
57.使用实施例1及实施例2的试剂盒按本发明的测试方法定标，其定标曲线比较如图2所示。后分别检测一份临床低值样本及一份临床高值样本，每份样本各检测三次，计算每次检测结果的偏差，如表1所示。
58.表1：本发明试剂盒的准确度检测结果
[0059][0060]
从表1可看出，临床样本铁蛋白含量检测结果的偏差均在
±
5％以内，说明分别使用了抗人铁蛋白单克隆抗体的实施例1和抗人铁蛋白多克隆抗体的实施例2都具有很好的检测准确度，本发明方法对抗人铁蛋白抗体的使用并不受限于单克隆抗体或多克隆抗体。
[0061]
使用实施例1及实施例2的试剂盒按本发明的测试方法定标，后分别检测两个不同铁蛋白含量的临床样本十次，计算十次检测结果的平均值，标准差sd 及变异系数cv，其结果如表2所示。
[0062]
表2：本发明试剂盒的精密度检测结果
[0063]
[0064][0065]
从表2可看出，两个血清样本的变异系数cv均在4.5％以内，说明本发明实施例的试剂盒有较高的精密度。
[0066]
本发明实施例多样，且各实施例实验数据较多，并不宜在本发明一一列出，对于本技术领域的技术人员在不偏离本发明原理的前提下做出的各种改动和改进，均应在本发明的权利要求内。