一种通过检测CTRB1蛋白表达水平来诊断胃肿瘤的试剂盒

一种通过检测ctrb1蛋白表达水平来诊断胃肿瘤的试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物医学领域技术领域，涉及一种通过检测ctrb1蛋白表达水平来诊断胃肿瘤的试剂盒，特别涉及检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒在制备用于胃肿瘤的判别诊断的酶联免疫吸附试剂盒中的应用。


背景技术：

2.胃癌是目前世界上死亡率排名第三位的恶性肿瘤。据统计，2018年全球有103.3万新发胃癌和78.3万胃癌死亡患者，其中发病率和死亡率最高的是亚洲东部地区，以中国最为普遍。
3.胃肿瘤是异质性非常强的肿瘤，近年来，由于诊断水平的不断提高，早期胃癌发现率的上升，加之外科手术方法的不断改进，其治疗的总体水平有了明显提高。但目前各种治疗手段依然面临着化疗药物敏感性差、特异性不高、缺乏有效的二线药物等问题。最为有效的方式是胃肿瘤在其早期发展过程中能够及时被发现，以避免患者错过最佳治疗时间，但现有的肿瘤标志物普遍存在敏感性差、特异性低等缺点。
4.目前，胃肿瘤最常检查的血清标准物主要包括cea、ca19-9，但由于在多种腺癌中均有水平升高，特异性不高，需多指标联合以提高阳性率。因此，寻找胃肿瘤早期标志物仍是一项亟待解决且迫在眉睫的国际难题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种通过检测ctrb1蛋白表达水平来诊断胃肿瘤的试剂盒。本发明以ctrb1蛋白水平作为筛选胃肿瘤标志物，具有突出的应用价值。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.一种检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒在制备诊断胃肿瘤的试剂盒中的应用。上述检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒只要满足可以检测体系中的ctrb1蛋白浓度的要求均可。
8.优选地，所述的检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒为酶联免疫试剂盒。
9.进一步地，所述的检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒中含有ctrb1蛋白、ctrb1蛋白抗体、ctrb1蛋白的标记物、ctrb1蛋白抗体的标记物中的一种或更多种。检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒可以用ctrb1蛋白和/或其抗体制备得到。
10.进一步地，所述的ctrb1蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述的单克隆抗体为体外培养杂交瘤细胞系获得的抗体或商业途径获得的抗体，所述的多克隆抗体为商业途径获得的抗体。单克隆抗体可购自santa cruz公司(货号sc-398721)。
11.优选地，所述的检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒为signal antibody公司生产的货号为ek13508的酶联免疫试剂盒，该试剂盒名称为human chymotrypsinogen b1(ctrb1)elisa kit。
12.一种诊断胃肿瘤的试剂盒，该试剂盒由检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒制备而
成。
13.优选地，所述的检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒为酶联免疫试剂盒。
14.进一步地，所述的检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒中含有ctrb1蛋白、ctrb1蛋白抗体、ctrb1蛋白的标记物、ctrb1蛋白抗体的标记物中的一种或更多种。检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒可以用ctrb1蛋白和/或其抗体制备得到。
15.进一步地，所述的ctrb1蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述的单克隆抗体为体外培养杂交瘤细胞系获得的抗体或商业途径获得的抗体，所述的多克隆抗体为商业途径获得的抗体。单克隆抗体可购自santa cruz公司(货号sc-398721)。
16.优选地，所述的检测ctrb1蛋白表达水平的试剂盒为signal antibody公司生产的货号为ek13508的酶联免疫试剂盒，该试剂盒名称为human chymotrypsinogen b1(ctrb1)elisa kit。
17.研究表明，分泌蛋白与细胞连接、转移、分化、增殖和肿瘤发生等密切相关，也是筛选肿瘤标志物的重要来源。本发明通过筛选发现胞外分泌蛋白ctrb1在胃癌组织微环境中间显著上调，进而创造性地以ctrb1蛋白水平作为筛选胃肿瘤标志物。
18.其中，诊断胃肿瘤的试剂盒可为常规的可检测ctrb1蛋白表达水平的酶联免疫试剂盒，通常包括固相载体、标记物以及可与标记物发生显色反应的底物。
19.固相载体的材料很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；固相载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。固相载体优选为聚苯乙烯制成的微量反应板凹孔，聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗原吸附其上后还是保留原来的免疫活性，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。
20.标记物为酶标记ctrb1蛋白、酶标记ctrb1蛋白抗体、生物素标记ctrb1蛋白或者生物素标记ctrb1蛋白抗体。标记物可以由ctrb1蛋白或ctrb1蛋白抗体制成。标记物所用的标记酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶或生物素，优选为辣根过氧化物酶。
21.当标记物为辣根过氧化物酶时，与酶标记物发生显色反应的底物由底物a和底物b组成，底物a为过氧化氢或过氧化脲，底物b为邻苯二胺(o-phenylenediamine，opd)、3’,3’,5’,5
’‑
四甲基联苯胺(3’,3’,5’,5
’‑
tetramethylbenzidine，tmb)或abts[2,2
’‑
azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]；当标记物为碱性磷酸酯酶时，底物为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；当标记物为生物素时，底物a为酶标亲和素，底物b为酶的底物。
[0022]
上述试剂盒可用于酶联免疫吸附检测ctrb1蛋白的表达水平，具体可为双抗体夹心法测定抗原。酶联免疫试剂盒还包括包被原，例如ctrb1蛋白抗体。双抗体夹心法所用的试剂盒，包被原为ctrb1蛋白抗体，标记物为酶标记ctrb1蛋白抗体或者生物素标记ctrb1蛋白抗体。
[0023]
ctrb1蛋白抗体优选为一抗，可为以ctrb1蛋白为抗原的单克隆抗体或多克隆抗体。ctrb1蛋白抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为鼠源抗体。当使用双夹心法时，需使用两种有不同抗原决定簇或不同物种来源的抗体，其中包被原优选为鼠源抗体。
[0024]
试剂盒还包括ctrb1蛋白标准品。ctrb1蛋白标准品可以是富集或表达、合成的人ctrb1全蛋白或包含ctrb1蛋白抗原决定簇的肽段。
[0025]
试剂盒中还包括浓缩样本稀释液、抗体稀释液、洗液、显色试剂、终止液等，这些试剂可用常规方法制备。
[0026]
与现有技术相比，本发明通过研究发现胃肿瘤患者血清中上调表达的蛋白质ctrb1，并提供了可以利用检测此种蛋白质的试剂盒作为诊断胃肿瘤的试剂盒的依据，以及利用该试剂盒诊断胃肿瘤的判定阈值标准，即利用其特性建立了诊断胃肿瘤的试剂盒，该试剂盒可用于胃肿瘤的临床检测。结果表明，ctrb1蛋白在胃肿瘤患者血清中较健康人群有明显高表达，因此本发明通过检测ctrb1蛋白浓度来诊断胃肿瘤的试剂盒在通过外周血诊断胃肿瘤的临床检验方面具有突出的应用价值。
附图说明
[0027]
图1为健康人及胃癌患者人群血清中ctrb1蛋白含量测定结果(混合样本，编号1-6为胃癌患者，编号7-15为健康人)；
[0028]
图2为ctrb1蛋白在正常对照组及胃癌患者组的血清样本中的elisa检测结果；
[0029]
图3为ctrb1蛋白水平的roc曲线分析结果。
具体实施方式
[0030]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0031]
下述实施方式中所用实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0032]
本发明通过实验发现，ctrb1蛋白在胃肿瘤病人血清中的表达量上调，并通过western blot进一步验证了该结论，具体的实验方法如下：
[0033]
对正常对照组(健康人)以及临床鉴定为胃癌患者组血清中ctrb1蛋白水平进行了western blot检测：首先对血清样本进行常规sds-page电泳，电转到硝酸纤维素膜上后放入封闭液(tbst中5％脱脂奶)中封闭1h，在1:1000稀释ctrb1蛋白一抗(santa cruz公司，sc-398721)中4℃孵育过夜，tbst洗膜5次，加入1:1000稀释羊抗鼠二抗(thermo公司，31430)室温下孵育1h，tbst缓冲液洗膜5次，ecl试剂盒(翊圣公司，36208es76)显色。
[0034]
结果如图1所示，可以看出ctrb1蛋白水平在胃癌组上调。该结果表明可以通过检测ctrb1蛋白表达水平来指征胃肿瘤。
[0035]
因此，本发明以上述结果为依据，应用ctrb1蛋白和/或其抗体建立通过检测ctrb1蛋白表达水平来诊断胃肿瘤的elisa检测试剂盒，其包括：固相载体、标记物以及可与标记物发生显色反应的底物；标记物为酶标记ctrb1蛋白、酶标记ctrb1蛋白抗体、生物素标记ctrb1蛋白或者生物素标记ctrb1蛋白抗体。具体试剂盒可由下述试剂组成：1)酶标板(固相载体)；2)人ctrb1标准蛋白；
[0036]
3)标记物；4)样本稀释液；5)抗体稀释液；6)洗液；7)显色试剂；8)终止液。
[0037]
本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，酶标板可以是一抗包被过的(用于双夹心elisa法、竞争法)或没有包被过的(用于直接elisa法)，人ctrb1标准蛋白可以是富集或表达、合成的全蛋白或包含抗原决定簇的肽段；标记物可以是辣根过氧化物酶标记或
生物素标记；显色试剂可以是tmb、opd或abts等。elisa方法可以是双夹心法、直接法或者竞争法。为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种：阴性对照、阳性对照等。
[0038]
该试剂盒的使用方法如下：
[0039]
1)酶标板用ctrb1抗体包被或不包被；
[0040]
2)用样本稀释液稀释人ctrb1标准蛋白至不同浓度，加入酶标板中孵育，用于制作标准曲线，用样本稀释液稀释人血清样本至一定浓度，加入酶标板中孵育，用于样本检测，孵育后用洗液冲洗；
[0041]
3)标记物用稀释液稀释为一定的工作液，加入酶标板中孵育，孵育后用洗液冲洗；
[0042]
4)加酶底物显色；
[0043]
5)加终止液终止反应；
[0044]
6)od值测定和结果计算。
[0045]
所用试剂为本领域技术人员所熟知的各种试剂。例如，步骤1)中酶标板可用ctrb1抗体包被(双夹心elisa法)或不包被(直接elisa法)；步骤3)中所使用标记物可采用辣根过氧化物酶或生物素标记；步骤4)中所使用酶显色底物可以是3’,3’,5’,5
’‑
四甲基联苯胺(3’,3’,5’,5
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tetramethylbenzidine，tmb)、邻苯二胺(o-phenylenediamine，opd)或abts[2,2
’‑
azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]等；步骤6)中所用波长与步骤4)中所用显色底物相对应；步骤1)、2)、3)中的抗体、蛋白或样本的具体稀释浓度可做适当调整。ctrb1抗体可使用商品化产品。elisa方法可以是双夹心法、直接法或者竞争法。
[0046]
以下述具体实施例来说明本发明的原理，验证本发明试剂盒的效果。
[0047]
实施例：
[0048]
利用检测ctrb1蛋白表达水平的酶联免疫试剂盒作为诊断胃肿瘤的试剂盒的效果验证。
[0049]
elisa试剂盒(双夹心elisa法)的组成：
[0050]
本实施例使用的检测ctrb1蛋白的酶联免疫试剂盒(双夹心elisa法，signalway antibody(sab)公司，货号ek13508，human chymotrypsinogen b1(ctrb1)elisa kit)，包括下述试剂：
[0051]
1)酶标板(固相载体，已包被ctrb1抗体)；
[0052]
2)人ctrb1蛋白标准溶液：浓度为400ng/ml，为genbank号x05006的ctrb1蛋白全长；
[0053]
3)hrp标记的人ctrb1抗体；
[0054]
4)样本稀释液；
[0055]
5)洗液；
[0056]
6)显色底物试剂(底物为tmb)；
[0057]
7)终止液。
[0058]
检测ctrb1蛋白的酶联免疫试剂盒诊断胃肿瘤的效果实验如下：
[0059]
对正常对照组17例、胃癌患者组18例的血清样本中的ctrb1水平进行elisa检测，具体方法如下：
[0060]
1、分别取ctrb1标准蛋白0ng/ml、1.56ng/ml、3.12ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、400ng/ml溶液100μl加入包被抗体的酶标板，每个梯度做3个
平行孔，用于制作标准曲线。
[0061]
2、正常对照组(健康人17例)、胃癌患者组(18例患者)的血清样本，各取2μl用样本稀释液稀释后(稀释倍数为1:100)，每例样本取100μl加入包被抗体的酶标板，每个样本做3个平行孔。以只加入样本稀释液的孔作为阴性对照。
[0062]
3、上述样本恒温(37℃)静置孵育2h后，每孔加300μl洗液洗涤3次，每次2分钟。
[0063]
4、每孔加入hrp标记的人ctrb1抗体100μl，37℃静置孵育1h后，每孔加300ul洗液洗涤4次，每次2分钟。
[0064]
5、加入显色底物试剂90μl/孔，37℃显色15分钟；加入终止液50μl/孔，450nm波长测定各孔样本的od值。
[0065]
6、通过标准品浓度和od值绘制标准曲线，通过各孔血清样本所测得的od值，计算各血清样本中ctrb1蛋白的含量。
[0066]
结果如图2所示，结果表明，ctrb1蛋白水平在胃肿瘤患者中上调，其中正常对照组ctrb1蛋白的浓度平均值为6.22μg/ml，胃癌患者组为16.68μg/ml。对各组样本中ctrb1蛋白含量进行统计学分析，发现胃癌患者组和正常对照组血清ctrb1蛋白水平有显著性差异。
[0067]
7、对胃癌患者组血清ctrb1蛋白水平进行roc曲线分析。
[0068]
通过graphpad prism软件对胃癌组血清ctrb1蛋白水平进行roc曲线分析，以正常对照组为对照组、胃癌患者组为疾病组，auc＝0.9420(如图3所示)，表明上述人体血清样本的elisa验证具有很高的可信性，说明ctrb1是可用于胃肿瘤患者判别诊断的潜在标志物。
[0069]
上述实验结果表明，ctrb1蛋白在胃肿瘤患者中有明显高表达。因此，本发明利用检测ctrb1蛋白表达水平的酶联免疫试剂盒作为诊断胃肿瘤的试剂盒，或者直接利用ctrb1蛋白和/或ctrb1蛋白抗体制备通过检测ctrb1蛋白浓度来诊断胃肿瘤的试剂盒，在临床检验方面具有应用价值。
[0070]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。