用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法

1.本发明涉及免疫分析技术和兽药残留检测技术领域，具体地说，涉及一种用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法。


背景技术：

2.多黏菌素b(polymyxin b，pmb)和粘菌素(colistin or polymyxin e，pme)是从多黏芽孢杆菌中分离获得的一类阳离子多肽类抗生素。发现于20世纪50年代，并被应用于临床，之后因为毒副作用被其他抗生素取代。但是为了应对革兰氏阴性多重耐药菌感染，大约于2000年被重新用于人医临床。在畜牧兽医领域，粘菌素作为饲料添加的促生长剂一直广泛应用，但是在2016年，中国禁止了多粘菌素作为饲料添加剂使用，但允许作为治疗药物使用。
3.人医临床上，多粘菌素的治疗窗口狭窄，人体差异大，为了满足个性化治疗，需要一种精确、快速的检测方法。其次在畜牧兽医领域，gb31650-2019中明确规定了动物组织中粘菌素的残留限量，其中牛奶和羊奶残留限量为50μg/kg。因此也需要对多粘菌素b和粘菌素进行快速有效地检测。
4.目前，多粘菌素b和粘菌素的检测手段主要为液相色谱、液质联用色谱方法，但由于大型仪器价格昂贵、对操作人员要求高，检测时间长等问题，严重限制了对于多粘菌素b和粘菌素使用的有效监管。
5.而基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析技术，具有速度快、操作性强、成本低的优点。其中荧光偏振免疫分析法是一种均相免疫分析方法，无需洗涤步骤，具有操作简单、速度快和等优点。因此开发一种简单、快捷、用于检测多粘菌素b和粘菌素的荧光偏振免疫分析方法显得尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法。
7.为了实现本发明目的，本发明提供的用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法，包括以下步骤：
8.1)配制不同浓度的多粘菌素标准品溶液，将多粘菌素标准品溶液分别与荧光标记物溶液和多粘菌素特异性抗体溶液混合孵育，进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；以测定的荧光偏振值为纵坐标，多粘菌素标准品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；
9.2)以待测样品代替步骤1)中的多粘菌素标准品，按照步骤1)中的方法，将所述待测样品与所述荧光标记物溶液和所述多粘菌素特异性抗体溶液混合孵育，进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值，根据步骤1)中的标准曲线，计算出所述待测样品中多粘菌素的浓度。
10.所述荧光标记物为hapten-m-fitc、hapten-2nm-fitc、hapten-4nm-fitc、hapten-6nm-fitc、hapten-smcc-fitc、hapten-2nm-cy5、hapten-4nm-cy5、hapten-6nm-cy5、
hapten-smcc-cy5、hapten-fitc、pmb-fitc或pme-fitc，它们的结构分别如下：
[0011][0012][0013][0014][0015]
[0016][0017][0018]
[0019][0020][0021]
[0022][0023]
其中，fitc(异硫氰酸荧光素)和cy5为荧光素。
[0024]
优选地，所述荧光标记物为hapten-2nm-fitc，其制备方法如下：
[0025]
s1、将1.0-2.0mg fitc(优选1.4mg)和0.64mg n-(2-氨乙基)-马来酰亚胺加入到400μl dmf中振荡至溶解，然后加入45-55μl(优选50μl)三乙胺，室温避光反应1天；
[0026]
s2、将2mg hapten加入到200μl dmf中振荡至溶解，加入s1的反应液中，室温避光反应1天；取50ul反应液用薄层色谱法(tlc)分离，展开剂为甲醇；从硅胶板上刮下r＝0.2的黄色条带，用甲醇水溶液洗脱，即为hapten-2nm-fitc。
[0027]
其中，hapten的结构如式i所示(参见cn202110932889.7)：
[0028][0029]
hapten的制备方法如下：
[0030]
(1)首先将氨基和侧链保护的半胱氨酸树脂(fmoc-s-三丁基-l-半胱氨酸4-苄氧苄酯树脂)在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9-芴甲氧羰基(fmoc)保护的n-端氨基，茚三酮试剂测试显色；
[0031]
(2)在偶联树脂中加入n，n-二异丙基乙胺(diea)、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)和(s)-4-(boc-氨基)-2-(fmoc-氨基)丁酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
[0032]
(3)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9-芴甲氧羰基(fmoc)保护的n-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
[0033]
(4)在偶联树脂中加入diea、hbtu和fmoc-o-叔丁基-l-苏氨酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
[0034]
(5)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9-芴甲氧羰基(fmoc)保护的n-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
[0035]
(6)在偶联树脂中加入diea、hbtu和(s)-4-(boc-氨基)-2-(fmoc-氨基)丁酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
[0036]
(7)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9-芴甲氧羰基(fmoc)保护的n-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
[0037]
(8)在偶联树脂中加入diea、hbtu和6-甲基庚酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，切割树脂，获得粗品肽；
[0038]
(9)上述粗品肽经hplc纯化后，真空冷冻干燥即获得式i所示的半抗原。
[0039]
前述的方法，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶0.5-1∶2(优选1∶1)。
[0040]
前述的方法，所述多粘菌素特异性抗体为多克隆抗体，是以hapten-klh为免疫原，免疫新西兰大白兔动物，采集血清作为多克隆抗体。
[0041]
前述的方法，步骤1)中用45-55mmol/l、ph值8.0-8.5的硼酸盐缓冲液配制多粘菌素标准品溶液。
[0042]
优选地，所配制的多粘菌素标准品溶液的浓度分别为2000ng/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml和0.128ng/ml。
[0043]
优选地，所述荧光标记物溶液的工作浓度为10nm。
[0044]
优选地，所述多粘菌素特异性抗体溶液的工作浓度为8μg/ml。
[0045]
优选地，所述多粘菌素标准品溶液、所述荧光标记物溶液和所述多粘菌素特异性抗体溶液以等体积比混合。
[0046]
前述的方法，竞争反应的条件为：20-25℃反应1-5min，避光孵育。
[0047]
所述荧光偏振值的测定条件为：当所述荧光标记物为hapten-m-fitc、hapten-2nm-fitc、hapten-4nm-fitc、hapten-6nm-fitc、hapten-smcc-fitc、hapten-fitc、pmb-fitc或pme-fitc时，激发波长为480nm，发射波长为530nm。
[0048]
当所述荧光标记物为hapten-2nm-cy5、hapten-4nm-cy5、hapten-6nm-cy5或hapten-smcc-cy5时，激发波长为620nm，发射波长为685nm。
[0049]
优选地，步骤1)中根据originpro 8.0软件中的四参数方程绘制标准曲线。
[0050]
本发明中，所述待测样品可以是动物性食品或血液，如牛奶和人血清。
[0051]
本发明方法适合于包括多粘菌素b、粘菌素在内的多种多粘菌素的检测。
[0052]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0053]
本发明提供一种均相快速的荧光偏振免疫分析方法。该方法无需洗涤和分离操作，10分钟左右即可获得检测结果。本发明通过对多粘菌素单克隆抗体、多克隆抗体和12种多粘菌素荧光标记物的筛选，建立了高效、灵敏的多粘菌素荧光偏振免疫分析方法。该方法在硼酸盐缓冲液中的灵敏度为3.7ng/ml，检测范围为1-13ng/ml。牛奶基质稀释了10倍，在牛奶中的检测限为2.7μg/l；人血清基质稀释了7.5倍，在人血清的检测限为1.4μg/l。该方法快速简便高通量，而且可以满足动物源性食品的多粘菌素残留检测限量要求以及人血液中多粘菌素血药浓度监测。
[0054]
本发明提供的多粘菌素荧光偏振免疫分析技术是一种无需分离和洗涤的均相免疫方法，具有高通量、便捷和可靠等优点。
附图说明
[0055]
图1为本发明较佳实施例中绘制的标准曲线。
[0056]
图2为本发明较佳实施例中荧光标记物hapten-m-fitc的质谱检测结果。
具体实施方式
[0057]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0058]
实施例1荧光标记物的制备
[0059]
1、荧光标记物hapten-m-fitc的制备
[0060]
称取2mg hapten和1.56mg 5-马来酰亚胺荧光素粉末，加入到400μl dmf中振荡至溶解；加入50ul三乙胺，室温避光反应3小时；取50ul反应液用薄层色谱法(tlc)分离，展开剂为甲醇；刮取硅胶板上刮下r＝0.2的黄色条带，甲醇∶水(v∶v，1∶1)洗脱，检测备用。
[0061]
质谱鉴定：荧光标记物hapten-m-fitc的化学式为：c
47h57
n7o
14
s，理论分子量为976.07。质谱实测值：976.1，与目标产物的分子量相吻合，质谱检测结果见图2。
[0062]
2、荧光标记物hapten-2nm-fitc、hapten-4nm-fitc、hapten-6nm-fitc、hapten-smcc-fitc荧光标记物的制备
[0063]
以hapten-2nm-fitc为例，合成方法如下：
[0064]
步骤1：1.4mg fitc，0.64mg n-(2-氨乙基)-马来酰亚胺，加入到400μl dmf中振荡至溶解；加入50ul三乙胺，室温避光反应1天。
[0065]
步骤2：2mg hapten加入到200μl dmf中振荡至溶解，加入步骤1的反应液中，室温避光反应1天；取50ul反应液用薄层色谱法(tlc)分离，展开剂为甲醇；刮取硅胶板上刮下r＝0.2的黄色条带，甲醇∶水(v∶v，1∶1)洗脱，检测备用。
[0066]
3、荧光标记物hapten-2nm-cy5、hapten-4nm-cy5、hapten-6nm-cy5、hapten-smcc-cy5荧光标记物的制备
[0067]
以hapten-2nm-cy5为例，合成方法如下：
[0068]
步骤1：0.75mg cy5，0.7mg n-(2-氨乙基)-马来酰亚胺，加入到400μl dmf中振荡至溶解；加入50ul三乙胺，室温避光反应1天。
[0069]
步骤2：1.64mg hapten加入到200μl dmf中振荡至溶解，加入步骤1的反应液中，室温避光反应1天；取50ul反应液用薄层色谱法(tlc)分离，展开剂为甲醇；刮取硅胶板上刮下r＝0.2的蓝色条带，甲醇∶水(v∶v，1∶1)洗脱，检测备用。
[0070]
4、荧光标记物hapten-fitc、pmb-fitc和pme-fitc荧光标记物的制备
[0071]
以hapten-fitc5为例，合成方法如下：
[0072]
称取1.4mg hapten和1mg fitc荧光素粉末，加入到400μl dmf中振荡至溶解；加入50ul三乙胺，室温避光反应1天；取50ul反应液用薄层色谱法(tlc)分离，展开剂为甲醇；刮取硅胶板上刮下r＝0.3的黄色条带，甲醇∶水(v∶v，1∶1)洗脱，检测备用。
[0073]
实施例2最佳荧光标记物和抗体组合的筛选
[0074]
1、分别用合成的12种荧光标记物与多粘菌素单克隆抗体(5d10、11d5、14g6和17d11)、多粘菌素多克隆抗体pab进行组合，首先将各荧光标记物的工作浓度均设定为荧光强度为缓冲溶液背景荧光强度的10倍时对应的荧光标记物的浓度(10nm)，各抗体用硼酸盐缓冲液按照1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、l/6400、1/12800、1/25600和1/51200稀释，绘制抗体结合曲线，获得信号强度的最大变化值δmp(δmp＝mp
max-mp
min
)。每个组合均选择δmp为80-120的抗体稀释浓度作为抗体的工作浓度。
[0075]
其中，多粘菌素单克隆抗体是通过细胞融合和杂交瘤制备方法获得的。
[0076]
多粘菌素多克隆抗体pab，是以hapten-klh为免疫原，免疫新西兰大白兔动物，采集血清作为多克隆抗体。
[0077]
2、首先将各荧光标记物的工作浓度均设定为荧光强度为b溶液背景荧光强度的10倍时对应的荧光标记物的浓度(10nm)，步骤1得出的抗体工作浓度条件下，建立不同标记物与不同抗体组合的标准曲线并计算ic
50
，根据各标准曲线的ic
50
值选出最佳荧光标记物。
[0078]
实验结果如表1所示。
[0079]
表1抗体和荧光标记物配对优化结果
[0080]
ic
50
(ng/ml)5d1011d5pab14g617d11hapten-m-fitc47194.74654hapten-2nm-fitc76465.145109hapten-4nm-fitc60445.44338hapten-6nm-fitc56161047106hapten-smcc-fitc＞2000＞200046.8＞2000＞2000hapten-2nm-cy532208.77250hapten-4nm-cy518.518.6204844hapten-6nm-cy516411111.845188hapten-smcc-cy532434663215332hapten-fitc7977326.3199363pmb-fitc123.8171.714.5193.7257pme-fitc＞2000＞2000＞2000＞2000＞2000
[0081]
由表1可知，最终选择的最佳荧光标记物与抗体组合为：hapten-m-fitc和多克隆抗体pab。
[0082]
实施例3 fpia方法的建立
[0083]
1、竞争fpia
[0084]
利用硼酸盐缓冲液(50mmol/l、ph8.0)分别配置2000ng/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml和0.128ng/ml不同浓度梯度的多粘菌素标准品溶液。在96黑色低结合微孔板中分别加入70ul多粘菌素标准品、70ul工作浓度为10nm的荧光标记物以及70ul工作浓度为8μg/ml的多粘菌素多克隆抗体溶液，室温避光孵育5min后测定荧光偏振值。
[0085]
2、绘制标准曲线
[0086]
竞争反应结束后，以测定的各孔荧光偏振值为纵坐标，多粘菌素标准品溶液的浓度为横坐标，利用origin 8.0的四参数模型拟合标准曲线。
[0087]
硼酸盐缓冲液中的多粘菌素荧光偏振标准曲线见图1。
[0088]
多粘菌素b和粘菌素的检测灵敏度为3.7ng/ml，检测范围为1-13ng/ml。牛奶基质稀释了10倍，牛奶中多粘菌素b和粘菌素的检测限为2.7μg/l；人血清基质稀释了7.5倍，在人血清的检测限为1.4μg/l。该方法快速简便高通量，而且可以满足动物源性食品的多粘菌素残留检测限量要求以及人血液中多粘菌素血药浓度监测。
[0089]
实施例4牛奶样品中多粘菌素的检测
[0090]
1、向15ml离心管中加入2ml牛奶和2ml的10％乙腈水溶液，涡动5min，静置20min，4
℃条件下12000g离心10min，取中间澄清部分1ml用硼酸盐缓冲液十倍稀释后用于fpia检测。
[0091]
2、添加回收率测定
[0092]
空白奶样以10000ng/ml的多粘菌素标准品添加，使其终浓度为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml，每个浓度设置三个平行，按照上述样品处理方法处理并检测，按照如下公式计算添加回收率：
[0093]
添加回收率(％)＝(测定值/添加值)
×
100％
[0094]
利用计算获得的检测回收率来评价本发明所建立的多粘菌素荧光偏振免疫检测方法的准确度；实验结果见表2。由表2可知，多粘菌素在牛奶中的平均添加回收率在68％-80％之间，变异系数小于14.2％；表明本发明建立的多粘菌素荧光偏振免疫检测方法可满足牛奶中多粘菌素的残留检测要求。
[0095]
表2牛奶中添加回收结果(n＝3)
[0096][0097]
实施例5人血清样品中多粘菌素的检测
[0098]
1、向15ml超滤离心管中加入1ml人血清，4℃条件下12000g离心20min，取超滤管滤出部分0.5ml用硼酸盐缓冲液7.5被稀释后用于fpia检测。
[0099]
2、添加回收率测定
[0100]
空白人血清以10000ng/ml的多粘菌素标准品添加，使其终浓度为5ng/ml、30ng/ml、200ng/ml，每个浓度设置三个平行，按照上述样品处理方法处理并检测，按照如下公式计算添加回收率：
[0101]
添加回收率(％)＝(测定值/添加值)
×
100％
[0102]
利用计算获得的检测回收率来评价本发明所建立的多粘菌素荧光偏振免疫检测方法的准确度；实验结果见表3。由表3可知，多粘菌素在牛奶中的平均添加回收率在73.8％-91.8％之间，变异系数小于12.8％；表明本发明建立的多粘菌素荧光偏振免疫检测方法可满足牛奶中多粘菌素的残留检测要求。
[0103]
表3人血清中添加回收结果(n＝3)
[0104][0105]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在
本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。