一种鉴别山乌桕蜂蜜真实性的方法

1.本发明属于食品检验技术领域，具体涉及一种鉴别山乌桕蜂蜜真实性的方法。


背景技术：

2.山乌桕(sapium discolor)为大戟科乌桕属植物，又称红叶乌桕，主要生长于浙江、江西、福建、台湾、广东、广西、云南及贵州等地，常生于山坡或山谷林中，喜深厚、湿润的土壤，是我国南方各地区重要蜜源植物之一。
3.山乌桕通常于5月下旬始花，6月上旬至中旬为盛花期，6月下旬基本结束。群体花期长，是一年之中的主要大流蜜期，也是中蜂蜂群在一年之中最为强盛的时期，平均年单产可达10-20kg/群。另外，山乌桕蜂蜜作为主要的单花蜜品种，其具有独特的营养价值和生物活性。
4.目前尚无有效鉴别山乌桕蜂蜜真实性的技术，并且我国尚未制定有关山乌桕蜂蜜的标准。有鉴于此，需要研制开发一种较为方便且准确、切实有效的鉴别山乌桕蜂蜜的方法。


技术实现要素：

5.为解决背景技术中的问题，本发明提供了一种鉴别山乌桕蜂蜜真实性的方法。发明人发现山乌桕素(n1,n5,n10-(e)三香豆酰亚精胺，cas号131086-78-7)在山乌桕蜂蜜中含量高且稳定，其在山乌桕蜂蜜中的含量范围是2.05-36.13mg/kg，因此将山乌桕素作为特征标记物应用于山乌桕蜂蜜的鉴别。
6.本发明的目的在于提供一种鉴别山乌桕蜂蜜真实性的方法，以山乌桕素作为特征标记物，若待测蜂蜜样品中山乌桕素含量为2.05-36.13mg/kg，则判断该样品为山乌桕蜂蜜，反之则判断其为其他蜂蜜或掺假山乌桕蜂蜜。
7.本发明具体是通过如下技术方案实现的：
8.一种鉴别山乌桕蜂蜜真实性的方法，包括以下步骤：
9.1)将待测蜂蜜样品溶于酸化水溶液中得到蜂蜜样品水溶液；
10.2)采用乙腈溶液对步骤1)所得蜂蜜样品水溶液提取，离心，收集上层乙腈提取液；
11.3)将步骤2)所得乙腈提取液稀释、过滤，得到上机待测溶液；
12.4)取步骤2)所得乙腈提取液加水稀释得到基质样品溶液，以基质样品溶液为溶剂，称取不同量的山乌桕素标准品，逐级稀释配制不同浓度的山乌桕素标准品基质工作液，通过色谱质谱联用仪进行数据采集，绘制外标曲线；
13.5)根据外标曲线和样品目标峰响应面积，计算样品中山乌桕素含量。
14.进一步地，步骤1)所述酸化水溶液ph为1-4，其与待测蜂蜜样品混溶比例为1-4:1，ml:g。
15.进一步地，步骤1)所述蜂蜜样品水溶液中还需加入氯化钠，氯化钠在蜂蜜样品水溶液中的浓度为5％-15％，w/v。
16.进一步地，步骤3)所述稀释采用的是乙腈提取液1-5倍体积的水。
17.进一步地，步骤3)所述过滤采用0.22μm亲水ptfe滤膜。
18.进一步地，步骤4)所述山乌桕素是n1,n5,n10-(e)三香豆酰亚精胺。
19.进一步地，步骤4)所述山乌桕素标准品基质工作液浓度分别为1800、1500、1200、1000、500、200、100、50、20ng/ml。
20.本发明的有益效果是：
21.本发明提供了一种鉴别方法，能够快速准确地鉴别出待测蜂蜜是否为山乌桕蜂蜜，为控制蜂蜜质量和维持市场秩序提供了保障。
附图说明
22.图1为标准溶液与蜂蜜样品溶液中山乌桕素色谱图。
23.图2为山乌桕素基质标准曲线。
24.图3为质控样与加标样的总离子流图和吸收光谱图。
25.图4为山乌桕素与标准品二级质谱对比。
26.图5为山乌桕素与标准品特征光谱对比。
27.图6为山乌桕素质谱裂解特征。
28.图7为图6的局部放大图。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.实施例
31.1.将2g待测蜂蜜溶解于4ml ph＝2的酸化水中涡旋混匀，同时在水溶液中加入氯化钠使氯化钠浓度为10％(w/v)，得到蜂蜜样品水溶液。
32.2.在所得蜂蜜样品水溶液中加入3ml纯乙腈溶液涡旋混合1min，于转速5000rpm、温度4℃下离心4min，移取上层提取液，在下层溶液中再加入等体积纯乙腈溶液重复提取一次，合并两次提取液并定容至6ml。
33.3.将0.5ml合并的乙腈提取液与1.5ml水涡旋混合后，过0.22μm亲水ptfe滤膜于液相小瓶中，待测。
34.4.按照1-2步骤提取后，取待测蜂蜜样品乙腈提取液0.5ml涡旋混匀为质控样品(qc)，同时取部分质控样品与水按1:3体积比稀释配制为基质样品溶液。称取一定量的山乌桕素标准品，甲醇溶解为储备液。用基质样品溶液作为溶剂，通过逐级稀释配制不同浓度的山乌桕素标准品基质工作液。山乌桕素标准品储备液浓度为400000ng/ml，工作液浓度分别为1800、1500、1200、1000、500、200、100、50、20ng/ml。
35.5.采用uplc-q-tof系统对蜂蜜提取液进行测定。色谱条件为：采用hss t3(2.1
×
100mm，1.8μm)色谱柱进行化合物分离，其中柱温为40℃。流动相a为含有0.02％甲酸水溶液，流动相b为纯乙腈，流速为0.4ml/min，进样体积5μl，按表1程序进行提取液的液相分离；质谱条件为：采用lockspray双电喷雾离子源(esi)，可同时采集分析物和校准化合物精确
质量数并进行全过程的质量数矫正。采集负离子模式下的质谱信息，设置参数信息如下：毛细管电压为2.5kv，样品锥电压为40v，脱溶剂气温度为20℃，离子源温度为120℃，质谱系统中的雾化、锥孔气为氮气，脱溶剂气流速为800l/h，反向锥孔气流速为50l/h，仪器启动后通过亮氨酸脑啡肽(le，leucine-enkephalin)和甲酸钠进行质量轴的检验调谐。数据采集软件为masslynx 4.1并设置数据采集模式为mse，该模式通过高、低碰撞能量(ce,collision energy)的切换可以同时采集一级母离子和二级碎片离子，其中数据结构为轮廓图，质量扫描范围为50-1200da，单次扫描时间为0.2s，高能量碰撞能随分子量递增high ce(hce)为10-45v，低能量碰撞能low ce(lce)为6v。实时校准化合物为le(0.1μg/ml)设置流速为10μl/min，电压为1.5kv。
36.6.山乌桕素的的精确分子量为583.2680，其一级分子离子峰为m/z 582.2610([m-h]-)，二级碎片离子峰应含有m/z 462.2034、316.1670、119.0503等中的一个或多个且离子m/z的偏差小于10ppm。山乌桕素的色谱保留时间为5.61min，偏差为
±
0.15min。获取基质标准溶液中山乌桕素的一级分子离子峰的峰面积，与对应浓度拟合标准曲线。获取样品溶液中山乌桕素的一级分子离子峰的峰面积，代入标准曲线计算含量(mg/kg)。
[0037]
表1液相分离洗脱程序
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以上所描述的实施例仅为本发明优选实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。