一种定性检测人类dna中apoe基因的多态性的方法
技术领域
1.本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体为一种定性检测人类 dna中apoe基因的多态性的方法。
背景技术：
2.apoe也叫载脂蛋白e是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与 代谢过程，其基因可以调节许多生物学功能，与许多眼科疾病发病有 关，对apoe及其基因多态性的研究是医学研究的热点之一，探讨两 者之间的内在联系，对眼病的预防、诊断及治疗具有重要的临床应用 价值，载脂蛋白e主要存在于cm、vldl、idl和部分hdl中，正常人 血浆apoe浓度为0.03～0.05g/l，apoe的浓度与血浆甘油三酯含量 呈正相关。
3.多态性是广义的多态性指多种表现形式，“多态性”一词最早用 于生物学，指同在一个生物群体，各个体之间存在的形态学、生理学 和生化学的差异，并非所有多态性都是可以遗传的，生物群体中，同 基因组存在2个或2个以上等位基因的现象称为遗传多态性，遗传多 态性的形成机制是基因突变，遗传多态性类型很多，从个体的整体到 细胞、再到蛋白质、基因水平均存在着遗传多态性，包括：表型多态 性、染色体多态性、蛋白质多态性、酶多态性、抗原多态性及dna多 态性，法医物证鉴定主要是通过对蛋白质多态性、酶多态性、抗原多 态性和dna多态性的分析解决司法实践中的个人识别和亲权鉴定的 问题，现有方法中还没有对载脂蛋白e进行多态性检测的完整流程， 难以精确的检测载脂蛋白e多态性。
技术实现要素：
4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种定性检测人类dna中 apoe基因的多态性的方法，解决了载脂蛋白e多态性检测不够完整， 数据不够精确的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种定性 检测人类dna中apoe基因的多态性的方法，包括以下步骤：
8.s1.前期准备
9.检测前，准备好相应的检测器械，然后再准备sds-page试剂、 匀浆缓冲液、转膜缓冲液、0.01m pbs、膜染色液和显色液；
10.s2.样品获取
11.经过细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真 核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min，然后4℃， 13,000r离心15min，取上清液作为样品；
12.s3.进行电泳
13.制备电泳凝胶，进行sds-page；
14.s4.半干式转移
15.电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min
×
3 次,然后进行膜处
理和转膜；
16.s5.四免疫反应
17.用0.01m pbs洗膜，5min
×
3次,加入包被液，平稳摇动，室温 2hr,弃包被液，用0.01m pbs洗膜，5min
×
3次,加入一抗,按合适稀 释比例用0.01m pbs稀释，液体必须覆盖膜的全部,4℃放置12hr以 上，阴性对照，以1％bsa取代一抗，其余步骤与实验组相同,弃一抗 和1％bsa，用0.01m pbs分别洗膜，5min
×
4次,加入辣根过氧化物酶 偶联的二抗,按合适稀释比例用0.01m pbs稀释,平稳摇动，室温2hr, 弃二抗，用0.01m pbs洗膜，5min
×
4次,加入显色液，避光显色至 出现条带时放入双蒸水中终止反应。
18.优选的，所述s1中匀浆缓冲液具体的为1.0m tris-hcl，ph 6.8， 1.oml，10％sds 6.0ml，β-巯基乙醇0.2ml，ddh2o 2.8ml。
19.优选的，所述s1中转膜缓冲液具体的为甘氨酸2.9g，tris5.8g，sds 0.37g，甲醇200ml，加ddh2o定容至1000ml。
20.优选的，所述s1中0.01m pbs具体的为nacl 8.0g，kcl 0.2g， na2hpo4 1.44g，kh2po4 0.24g，加ddh2o至1000ml。
21.优选的，所述s1中膜染色液具体的为考马斯亮兰0.2g，甲醇 80ml，乙酸2ml，ddh2o118 ml，包被液，5％脱脂奶粉，现配，脱脂 奶粉1.0g溶于20ml的0.01m pbs中。
22.优选的，所述s1中显色液具体的为dab 6.0mg，0.01m pbs 10.0ml， 硫酸镍胺0.1ml，h202 1.0μl。
23.优选的，所述s4中膜处理具体的为预先裁好与胶条同样大小的 滤纸和nc膜，浸入转膜缓冲液中10min。
24.优选的，所述s4中转膜具体的为转膜装置从下至上依次按阳极 碳板、24层滤纸、nc膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好， 滤纸、凝胶、nc膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将 碳板上多余的液体吸干，接通电源，恒流1ma/cm2，转移1.5hr，转 移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹，将有蛋白 标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50％甲醇中多次脱色， 至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色 结果作对比。
25.(三)有益效果
26.本发明提供了一种定性检测人类dna中apoe基因的多态性的方 法。具备以下有益效果：
27.本发明提供了一种定性检测人类dna中apoe基因的多态性的方 法，该方法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探 针”是抗体，“显色”用标记的二抗，经过page分离的蛋白质样品， 转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持 电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或 多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性 目的基因表达的蛋白成分，这样即可实现对载脂蛋白e多态性的检 测，操作简单，检测方便，数据更加全面和准确。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描
述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部 的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例：
30.本发明实施例提供一种定性检测人类dna中apoe基因的多态性 的方法，包括以下步骤：
31.s1.前期准备
32.检测前，准备好相应的检测器械，然后再准备sds-page试剂、 匀浆缓冲液、转膜缓冲液、0.01m pbs、膜染色液和显色液，匀浆缓 冲液具体的为1.0m tris-hcl，ph 6.8，1.oml，10％sds 6.0ml，β
‑ꢀ
巯基乙醇0.2ml，ddh2o 2.8ml，转膜缓冲液具体的为甘氨酸2.9g， tris 5.8g，sds 0.37g，甲醇200ml，加ddh2o定容至1000ml，0.01m pbs具体的为nacl 8.0g，kcl 0.2g，na2hpo4 1.44g，kh2po4 0.24g， 加ddh2o至1000ml，膜染色液具体的为考马斯亮兰0.2g，甲醇80ml， 乙酸2ml，ddh2o118 ml，包被液，5％脱脂奶粉，现配，脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01m pbs中，显色液具体的为dab 6.0mg，0.01m pbs 10.0ml，硫酸镍胺0.1ml，h202 1.0μl；
33.s2.样品获取
34.经过细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真 核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min，然后4℃， 13,000r离心15min，取上清液作为样品；
35.s3.进行电泳
36.制备电泳凝胶，进行sds-page；
37.s4.半干式转移
38.电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min
×
3 次,然后进行膜处理和转膜，膜处理具体的为预先裁好与胶条同样大 小的滤纸和nc膜，浸入转膜缓冲液中10min，转膜具体的为转膜装 置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、nc膜、凝胶、24层滤纸、 阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、nc膜精确对齐，每一步去除气 泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干，接通电源，恒流 1ma/cm2，转移1.5hr，转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测 膜条做免疫印迹，将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后， 在50％甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两 层滤纸中保存，留与显色结果作对比；
39.s5.四免疫反应
40.用0.01m pbs洗膜，5min
×
3次,加入包被液，平稳摇动，室温 2hr,弃包被液，用0.01m pbs洗膜，5min
×
3次,加入一抗,按合适稀 释比例用0.01m pbs稀释，液体必须覆盖膜的全部,4℃放置12hr以 上，阴性对照，以1％bsa取代一抗，其余步骤与实验组相同,弃一抗 和1％bsa，用0.01m pbs分别洗膜，5min
×
4次,加入辣根过氧化物酶 偶联的二抗,按合适稀释比例用0.01m pbs稀释,平稳摇动，室温2hr, 弃二抗，用0.01m pbs洗膜，5min
×
4次,加入显色液，避光显色至 出现条带时放入双蒸水中终止反应。
41.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术 人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这 些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权 利要求及其等同物限定。