一种同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质的方法与流程

本发明属于原料药分析，具体涉及一种同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质的方法。

背景技术：

1、比拉斯汀(bilastine)是西班牙faes制药公司开发的第2代组胺h1受体拮抗剂，2010年欧盟批准其用于治疗变应性鼻炎及慢性特发性荨麻疹。本品安全性好，无常用抗组胺药物存在的镇静作用及心脏毒性。比拉斯汀化学名2-[4-(2-(4-(1-(2-乙氧基乙基)苯并咪唑-2-基)哌啶-1-基)乙基)苯基]-2-甲基丙酸，分子式为c28h37n3o3。比拉斯汀结构式为：

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3、比拉斯汀制备过程中存在的1个工艺杂质及4个基因毒性杂质(其化学名称及结构式如下表1所示)，对于制备比拉斯汀过程中产生的基因毒性杂质，不论是在原料药还是制剂中均需要进行严格控制。基因毒性杂质是指能直接或间接损伤细胞dna，产生致突变和致癌作用的物质。临床研究发现甲磺酸酯的dna烷基化作用会导致诱变效应，其中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯已有这方面报导，因此有理由怀疑其它低分子量磺酸(如对甲苯磺酸)的烷基酯可能也存在着类似的毒性影响。尽管无数据表明这些酯对人的毒性影响，然后依然有上述基因毒性物质以杂质的形式存在于含磺酸酯类药物活性成分的药品中的潜在风险。

4、表1比拉斯汀相关杂质名称与结构式

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6、

7、现有专利cn109580825b公开了消旋卡多曲中对甲苯磺酸酯类物质的检测方法。该方法以德国默克lichrospher rp 18为色谱柱，采用hplc检测方法对消旋卡多曲中的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯进行定性和定量分析。该专利方法中检测限平均水平为0.5ppm，灵敏度较低，而且检测时间较长。

8、现有专利cn107014909a公开了一种泊沙康唑中间体z及其相关基因毒性杂质的分离与测定方法。所述的方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以溶剂a与溶剂b的混合物为流动相进行分离，该方法能够实现中间体z及相关基因毒性杂质的有效分离。所述的分离测定方法是采用高效液相色谱法，取中间体z及相关基因毒性杂质对照品分别制备成对照品溶液和供试品溶液，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，按照面积归一化法计算供试品中所含泊沙康唑中间体z及相关基因毒性杂质的含量，实现中间体z及相关基因毒性杂质的有效分离与检测。该方法仅仅分离测定泊沙康唑中间体z及其杂质对甲苯磺酸甲酯和/或对甲苯磺酸乙酯，杂质种类比较少，且检测灵敏度较低。

9、综上所述，现有没有文献记载采用高效液相色谱法同时分离和测定比拉斯汀的1种工艺杂质对甲苯磺酸和/或4种基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯和对甲苯磺酸正丁酯的方法，仅仅公开了非比拉斯汀原料药中其中几种杂质的分离测定方法，而且其检测方法检测线较高，灵敏度较低。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明目的在于提供一种同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质(1种工艺杂质、4种基因毒性杂质中至少一种)的方法，该方法可在45分钟内将比拉斯汀及1种工艺杂质和4种基因毒性杂质完全分离并进行检测。

2、所述相关杂质为式i(对甲苯磺酸)、式ii(对甲苯磺酸甲酯)、式iii(对甲苯磺酸乙酯)、式iv(对甲苯磺酸异丙酯)、式v(对甲苯磺酸正丁酯)所示化合物中的一种或多种；

3、

4、具体地，基因毒性杂质，应按基因毒性杂质控制限度的每日最大允许摄入量为1.5μg/天计。本品最大日剂量按20mg/天，根据基因毒性杂质每日最大允许摄入量和本品日剂量计算，基因毒性杂质拟控制限度为0.0075％((1.5μg/天)/(20000μg/天)×1000000ppm＝75ppm)，其中，对甲苯磺酸酯类基因毒性杂质控制限度的总和为0.0075％。基因毒性杂质控制限度低，灵敏度是基因毒性杂质质量控制的难点和重点，本发明实现以更高的灵敏度对比拉斯汀中1种工艺杂质和4种基因毒性杂质的检测，提高了检测对甲苯磺酸酯类基因毒性杂质的灵敏度和种类。

5、所述同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质的方法，包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，以流动相a和流动相b为流动相进行梯度洗脱；所述流动相a为色谱用有机溶剂，所述流动相b选自磷酸盐缓冲体系；所述梯度洗脱的程序为：

6、0≤t＜30min，所述流动相a与所述流动相b的体积比为80-90:10-20，

7、30min≤t≤35min，所述流动相a与所述流动相b的体积比为25-35:65-75，

8、t＞35min，所述流动相a与所述流动相b的体积比为80-90:10-20。

9、优选地，所述梯度洗脱的程序为：

10、0≤t＜30min，所述流动相a与所述流动相b的体积比为85:15，

11、30min≤t≤35min，所述流动相a与所述流动相b的体积比为30:70，

12、t＞35min，所述流动相a与所述流动相b的体积比为85:15。

13、优选地，所述色谱用有机溶剂选自乙腈、甲醇中的种或多种混合。

14、进一步，所述磷酸盐缓冲体系选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和磷酸二氢铵中的一种或多混合。优选为磷酸二氢钾。

15、进一步，所述磷酸盐缓冲体系的ph值为2.8-3.2。优选为3。

16、进一步，所述磷酸盐缓冲体系中无机盐的浓度为0.015mol/l-0.025mol/l。优选为0.02mol/l。

17、进一步，所述流动相流速为0.9-1.1ml/min。

18、进一步，所述色谱柱的温度为33-37℃。优选为35℃。

19、优选地，所述色谱柱选择boston green ods-2。

20、进一步，采用色谱纯甲醇溶解待检测样品。

21、本发明目的进一步提供一种测定比拉斯汀和其相关杂质的方法，所述方法包括：先使用前任一所述的同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质的方法进行分离，然后进入检测器进行检测。

22、优选地，所述检测器的检测波长为220nm。

23、进一步，所述检测器在某些情况下可以使用质谱仪进行替代。

24、在某些具体实施例中，测定比拉斯汀和其相关杂质的方法如下：

25、(1)取比拉斯汀适量，用甲醇溶解样品，配制成每1ml含比拉斯汀5.0mg的样品溶液；

26、(2)选用型号为岛津lc-2030的色谱仪，色谱柱型号为boston green ods-2(4.6mm×250mm，5μm)，流动相a的配制：称取2.7g磷酸二氢钾(0.02mol/l磷酸二氢钾)于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节ph值至3.0±0.2；流动相b为乙腈；取步骤(1)的样品溶液20μl注入液相色谱仪中，设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，色谱柱柱箱温度为35℃，按下表2所示的数据进行线性梯度洗脱，完成比拉斯汀潜在杂质的分离及测定。

27、表2进行线性梯度洗脱流动相a和流动相b的体积

28、 时间(min) 0 30 35 36 45 流动相a(％) 85 30 30 85 85 流动相b(％) 15 70 70 15 15

29、本发明有益效果在于

30、本发明提供的同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质的方法能同时将比拉斯汀和其工艺杂质、基因毒性杂质(对甲苯磺酸、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯和对甲苯磺酸正丁酯)中的至少一种完全分离，方法简便可行，重现性好，最高可以同时在45min内有效分离及高灵敏(达ppm级)测定比拉斯汀原料药中1种工艺杂质和4种基因毒性杂质的含量，专属性强。

31、本发明提供的同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质的方法相比现有专利cn109580825b已公开的技术内容，本发明主药不同，且增加了对杂质甲苯磺酸和对甲苯磺酸正丁酯的分离检测；但是杂质洗脱梯度程序更少，检测时间更短。而且，专利cn109580825b中检测限平均水平为0.5ppm，而本专利中对甲苯磺酸检测限为0.0126ppm，对甲苯磺酸甲酯检测限为0.0122ppm，对甲苯磺酸乙酯检测限为0.0130ppm，对甲苯磺酸异丙酯检测限为0.0125ppm，对甲苯磺酸正丁酯检测限为0.0122ppm，本发明方法的灵敏度相比cn109580825b的方法提高了大约40倍的水平。

32、本发明提供的同时分离测定比拉斯汀和其相关杂质的方法相比现有专利cn107014909a的方法，本发明方法主药不同，且增加了对甲苯磺酸、对甲苯磺酸异丙酯和对甲苯磺酸正丁酯的分离检测；而且本发明中，对甲苯磺酸检测限为0.0126ppm，对甲苯磺酸甲酯检测限为0.0122ppm，对甲苯磺酸乙酯检测限为0.0130ppm，对甲苯磺酸异丙酯检测限为0.0125ppm，对甲苯磺酸正丁酯检测限为0.0122ppm，灵敏度高于现有专利cn107014909a中的检测方法。