一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法与流程

1.本发明涉及病理免疫组化石蜡切片预处理，属病理检测试剂技术领域，尤其涉及一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法。


背景技术：

2.免疫组化（ihc）是目前病理诊断过程中不可或缺的重要技术手段，是肿瘤确诊、分型鉴定、指导用药、预后评价及疗效评估等方面起到了不可估量的作用。病理石蜡组织切片是免疫组化（ihc）最常用的也是最主要的检测样本。由于该样本为石蜡包埋的组织切片，非水溶性的，不能直接用于免疫组化检测，在免疫组化检测前需要对样本进行预处理，即需要脱蜡、水化、抗原修复及内源性过氧化物酶阻断的处理。经典的石蜡组织切片预处理基本步骤为：二甲苯（或环保脱蜡剂）脱蜡、乙醇梯度水化（如无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、蒸馏水）、抗原修复、漂洗、阻断、再漂洗。经过一系列操作过程处理后，方可进行石蜡切片的免疫组化的染色反应。
3.经典的石蜡组织切片脱蜡、水化、修复及阻断，不仅操作步骤复杂，而且脱蜡往往需要使用二甲苯，二甲苯具有一定的毒性，环境不友好，对操作者也会带来一定的伤害。替代经典的脱蜡、水化、修复及阻断的是技术发展的必然趋势。


技术实现要素：

4.本发明涉及一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液（高ph）配制及其应用，可用于石蜡组织切片等在加热的条件下脱蜡、抗原修复及内源性过氧化物酶阻断，经处理后的组织切片马上就可以进行免疫组织化学染色。本复合液组分包括：水性溶蜡剂、组织渗透剂、分散剂、消泡剂、组织保护剂、阻断剂及高ph值修复液（含有triton x-100、edta、tris等）等。本发明的复合液在72-75℃温育条件下，脱蜡效果与二甲苯的脱蜡效果相同，无毒性、不挥发、无味，为环保型的温育水性脱蜡剂；在95-100℃加热条件下，一次性完成脱蜡、抗原修复作用的同时，还能达到内源性过氧化物酶的阻断效果，热处理后的石蜡组织切片漂洗后即可进行免疫组织化学的染色。脱蜡、抗原修复及阻断一次性完成，具有方法简便、实验操作时间短、不易掉片、环保无毒等优点。
5.本发明提出了一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制及其应用，为了实现本发明的目的，通过脱蜡修复阻断复合液的配制，然后进行了脱蜡、脱蜡修复及脱蜡修复阻断的三级技术验证。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法，包括以下步骤：s1：制备水性脱蜡剂；s2：制备修复液；s3：制备内源性过氧化物酶阻断剂；s4：配置复合液。
7.优选的，所述s1中，所述水性脱蜡剂由水溶性脱蜡剂、组织渗透剂、分散剂、消泡剂和蒸馏水混合制备而成。
8.优选的，所述水溶性脱蜡剂由0.25-2.5%的peg200、0.05-0.75%的乙二醇、0.25-1.00%的四氢化呋喃-2-甲醇和0.05-0.85%的脂肪醇聚氧乙烯醚混合组成；本发明利用peg200、乙二醇、四氢化呋喃-2-甲醇、脂肪醇聚氧乙烯醚等组成的混合物，在水相中具有良好的溶解性，在加热的情况下可以溶解石蜡；所述组织渗透剂由0.1-0.75%的triton x-100和0.01-0.5%的丙三醇混合组成；本发明使用triton x-100、丙三醇，可以两种或至少一种的化合物。
9.优选的，所述分散剂由0.1-0.75%的triton x-100和0.01-0.05%的tween-20混合组成；分散剂为表面活性剂，如tween-20、triton x-100，至少一种化合物；所述消泡剂由0.01-0.1%的乙二醇叔丁醚和0.03-0.05%的聚氧丙烯甘油醚混合组成；配制的脱蜡修复阻断复合液中乙二醇叔丁醚和聚氧丙烯甘油醚，二种或至少一种化合物。
10.优选的，所述s2中，所述修复液由缓冲液、组织渗透剂和金属螯合剂制备而成。
11.优选的，所述缓冲液为0.01-0.05mm的tris-hcl，且缓冲液的ph为9.0；缓冲液为修复液中的主要组分，由tris盐酸配制而成；所述金属螯合剂为0.001-0.002mm的edta；可以减少金属离子的干扰；所述组织渗透剂由0.01-0.05%的丙三醇和0.1-0.75%的triton x-100混合组成。
12.优选的，所述s3中，所述内源性过氧化物酶阻断剂由还原剂制备而成；其中还原剂为0.1-0.5%柠檬酸亚锡二钠；可以灭活组织内部的过氧化物酶的活性。
13.优选的，所述s4中，利用水性脱蜡剂、修复液和内源性过氧化物酶阻断剂配置复合液。
14.优选的，其复合液具有脱蜡的作用及其脱蜡步骤是：在72-75℃温育的条件下，即可完成脱蜡作用。即：石蜡组织切片置于60-65℃烤箱中烤30-60分钟，然后将切片放入预先加热到72-75℃的复合液中，恒温浸泡20分钟；取出切片后再次直接放入另一缸预先加热到72-75℃的复合液中，恒温浸泡20分钟，然后用水冲洗即完成脱蜡；该操作，由于没有在沸水环境下进行，还需要经过抗原修复、与内源性过氧化物酶阻断才能用于ihc染色；复合液用于单纯脱蜡操作时，其加热脱蜡温育温度为72-75℃；其加热脱蜡温育时间为20分钟，并恒温浸泡两次；其加热脱蜡完成后漂洗用水为自来水或pbs缓冲液。
15.优选的，其脱蜡及抗原修复步骤是：在95-100℃加热的条件下，一次完成脱蜡与抗原修复作用。即：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤30-60分钟，然后将切片放入预先加热到72-75℃的复合液中，将复合液继续加热到95-100℃，持续20分钟；取出切片后先用预先加热到72-75℃的复合液中漂洗一次，然后用水冲洗即完成脱蜡修复；在后续操作中，可以依据常规操作进行内源性过氧化物酶的阻断，再用于ihc染色，复合液在脱蜡修复操作时，其复合液需要预先加热到72-75℃，石蜡组织切片不能直接放入冷的复合液中，以免影响切片上的石蜡粘附于玻片上，不利于溶蜡与蜡质的扩散；放入石蜡组织切片后需将复合液继续加热到95-100℃，此温度条件下不仅可以促进脱蜡，同时还可以达到抗原修复的目的；放入石蜡组织切片后需将复合液继续加热到95-100℃进行脱蜡修复，持续时间需要20分钟；完成脱蜡修复的石蜡组织切片，取出后应先用预热至72-75℃的复合液漂洗一次，然后才能用自来水或蒸馏水冲洗。
16.优选的，其脱蜡、抗原修复及内源性过氧化物酶阻断步骤是：复合液使用时已经含有阻断剂，在95-100℃加热的条件下，一次完成脱蜡、抗原修复与内源性过氧化物酶阻断作用。即：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤30-60分钟，然后将切片放入预先加热到72-75℃的复合液中，将复合液继续加热到95-100℃，持续20分钟；取出切片后先用预先加热到72-75℃的复合液中漂洗一次，然后用水冲洗即完成脱蜡修复阻断等的过程；此时的石蜡切片可以直接用于ihc染色，复合液在脱蜡修复阻断操作时，完成脱蜡修复阻断的石蜡组织切片，取出后应先用预热至72-75℃的复合液漂洗一次，然后用自来水或蒸馏水冲洗，即可完成内源性过氧化物酶的阻断作用，不需附加其他操作。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的脱蜡修复阻断复合液所用化学试剂均无毒、无挥发性、无刺激性气味，加入了消泡剂后在加热的状态下，可以有效地防止液体试剂的挥发而产生刺激性气体，同时防止在玻片表面形成气泡而影响脱蜡修复效果。脱蜡修复阻断复合液与二甲苯脱蜡效果基本一致，且对操作人员身体健康无影响，也不会产生有毒的废液。本发明的脱蜡修复液用于病理ihc检测技术，使用过程不会对组织细胞结构和组织细胞内有效成分以及组织抗原造成破坏，符合临床病理诊断和研究所要求优质染色片的要求。
18.本发明的脱蜡修复阻断复合液用于病理ihc检测效果良好，在脱蜡的同时进行抗原修复与内源性过氧化物酶的阻断，脱蜡-水化-修复-阻断一次性完成，缩短了操作步骤，节约了实验时间。
附图说明
19.图1为本发明提出的一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法的流程图；图2为本发明提出的一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法的脱蜡修复液he染色结果（肺癌）图；图3为本发明提出的一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法的ihc染色结果（肺癌、ttf-1）图；图4为本发明提出的一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法的脱蜡修复液he染色结果（肺癌）图；图5为本发明提出的一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法的ihc染色结果（扁桃体、ck5/6）图；图6为本发明提出的一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法的脱蜡修复液he染色结果（肺癌）图；图7为本发明提出的一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法的ihc染色结果（扁桃体、p63）图。
具体实施方式
20.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
21.实施例一
参照图1，一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法，包括以下步骤：s1：制备水性脱蜡剂；s2：制备修复液；s3：制备内源性过氧化物酶阻断剂；s4：配置复合液。
22.本实施例中，所述s1中，所述水性脱蜡剂由水溶性脱蜡剂、组织渗透剂、分散剂、消泡剂和蒸馏水混合制备而成。
23.本实施例中，所述水溶性脱蜡剂由0.5%的peg200、0.5%的乙二醇、0.55%的四氢化呋喃-2-甲醇和0.15%的脂肪醇聚氧乙烯醚混合组成；所述组织渗透剂由0.1%的triton x-100和0.25%的丙三醇混合组成。
24.本实施例中，所述分散剂为0.01%的tween-20；所述消泡剂为0.02%的乙二醇叔丁醚。
25.本实施例中，所述s2中，所述修复液由缓冲液、组织渗透剂和金属螯合剂制备而成。
26.本实施例中，所述缓冲液为0.01mm的tris-hcl，且缓冲液的ph为9.0；所述金属螯合剂为0.001mm的edta；所述组织渗透剂由0.1%的triton x-100和0.25%的丙三醇混合组成。
27.本实施例中，所述s3中，所述内源性过氧化物酶阻断剂由还原剂制备而成；其中还原剂为0.3%柠檬酸亚锡二钠。
28.本实施例中，所述s4中，利用水性脱蜡剂、修复液和内源性过氧化物酶阻断剂配置复合液。
29.配制操作步骤1：配制0.01mm tris-hcl（ph9.0）缓冲液，加入edta使其浓度达到0.001mm，即为抗原修复液。称取tris 1.21g与edta 0.29g，溶解于1l蒸馏水中，充分溶解后，用盐酸调节ph值为9.0即可。
30.配制操作步骤2：依据以上组成比例，依次量取水溶性脱蜡剂（peg200、乙二醇、脂肪醇聚氧乙烯醚、四氢化呋喃-2-甲醇）、渗透剂（triton x-100、丙三醇）、分散剂（tween-20）、消泡剂（乙二醇叔丁醚）加入到步骤1的抗原修复液中，充分搅拌溶解即可。此时溶液即为复合液a液。
31.配制操作步骤3：用纯化水配制3%的柠檬酸亚锡二钠水溶液，即为复合液b液。
32.配制操作步骤4：复合液临用时，将b液加入到a液中，b液的最终浓度为0.3%。
33.本实施例中，其配制的复合液在免疫组化实验中充当脱蜡剂的作用（含水化作用）：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤60分钟，然后将切片放入预先加热到75℃复合液中，恒温浸泡20分钟；取出切片后再次直接放入另一缸预先加热到75℃复合液中，恒温浸泡20分钟，然后用水冲洗即完成脱蜡并完成水化作用。脱蜡水化的病理切片,进行he染色、脱水、透明和封片。
34.参照图2，结果显示切片表面没有留蜡、脱蜡干净、组织细胞形态完整、染色清晰、明显、说明使用本试剂处理的病理切片具有良好的脱蜡效果，且不会损坏病理组织细胞结构。
35.本实施例中，其配制的复合液在免疫组化实验中脱蜡、水化、抗原修复及内源性过氧化物酶阻断作用：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤60分钟，然后将切片放入预先加热到75℃复合液中，将复合液继续加热到100℃，持续20分钟；取出切片后先用预先加热到75℃复合液中漂洗一次，然后用水冲洗即完成脱蜡修复阻断；参照图3，ttf-1在肺癌组织上染色结果显示，切片表面的蜡没有明显的留存，脱蜡效果明显干净，经ttf-1染色可以看出抗原修复良好，组织细胞形态保留良好的原始状态及其完整性，ttf-1阴性表达的细胞细胞核苏木素染色清晰、明显，ttf-1阳性染色信号清晰、明确。该复合液符合组织切片的免疫组化的脱蜡、水化、抗原修复及阻断的要求。
36.实施例二参照图1，一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法，包括以下步骤：s1：制备水性脱蜡剂；s2：制备修复液；s3：制备内源性过氧化物酶阻断剂；s4：配置复合液。
37.本实施例中，所述s1中，所述水性脱蜡剂由水溶性脱蜡剂、组织渗透剂、分散剂、消泡剂和蒸馏水混合制备而成。
38.本实施例中，所述水溶性脱蜡剂由2.5%的peg200、0.25%的乙二醇、0.75%的四氢化呋喃-2-甲醇和0.05%的脂肪醇聚氧乙烯醚混合组成；所述组织渗透剂由0.05%的triton x-100和0.25%的丙三醇混合组成。
39.本实施例中，所述分散剂为0.01%的tween-20；所述消泡剂为0.05%的聚氧丙烯甘油醚。
40.本实施例中，所述s2中，所述修复液由缓冲液、组织渗透剂和金属螯合剂制备而成。
41.本实施例中，所述缓冲液为0.01mm的tris-hcl，且缓冲液的ph为9.0；所述金属螯合剂为0.001mm的edta；所述组织渗透剂由0.05%的triton x-100和0.25%的丙三醇混合组成。
42.本实施例中，所述s3中，所述内源性过氧化物酶阻断剂由还原剂制备而成；其中还原剂为0.3%柠檬酸亚锡二钠。
43.本实施例中，所述s4中，利用水性脱蜡剂、修复液和内源性过氧化物酶阻断剂配置复合液。
44.配制操作步骤1：配制0.01mmtris-hcl（ph9.0）缓冲液，加入edta使其浓度达到0.001mm，即为抗原修复液。称取tris 1.21g与edta 0.29g，溶解于1l蒸馏水中，充分溶解后，用盐酸调节ph值为9.0即可。
45.配制操作步骤2：依据以上组成比例，依次量取水溶性脱蜡剂（peg200、乙二醇、四氢化呋喃-2-甲醇、脂肪醇聚氧乙烯醚）、渗透剂（triton x-100、丙三醇）、分散剂（tween-20）、消泡剂（聚氧丙烯甘油醚）加入到步骤1的抗原修复液中，充分搅拌溶解即可。此时溶液即为复合液a液。
46.配制操作步骤3：用纯化水配制3%的柠檬酸亚锡二钠水溶液，即为复合液b液。
47.配制操作步骤4：复合液临用时，将b液加入到a液中，b液的终浓度为0.3%。
48.本实施例中，其配制的复合液在免疫组化实验中充当脱蜡剂的作用（含水化作用）：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤60分钟，然后将切片放入预先加热到75℃复合液中，恒温浸泡20分钟；取出切片后再次直接放入另一缸预先加热到75℃复合液中，恒温浸泡20分钟，然后用水冲洗即完成脱蜡并完成水化作用。脱蜡水化的病理切片、进行he染色、脱水、透明和封片。
49.参照图4，结果显示切片表面没有留蜡、脱蜡干净、组织细胞形态完整、染色清晰、明显、说明使用本试剂处理的病理切片具有良好的脱蜡效果，且不会损坏病理组织细胞结构。
50.本实施例中，其配制的复合液在免疫组化实验中脱蜡、水化、抗原修复作用：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤60分钟，然后将切片放入预先加热到75℃复合液中，将复合液继续加热到100℃，持续20分钟；取出切片后先用预先加热到75℃复合液中漂洗一次，然后用水冲洗即完成脱蜡修复阻断。
51.参照图5，ck5/6在扁桃体组织上染色结果显示，切片表面的蜡没有明显的留存，脱蜡效果明显干净，经ck5/6染色可以看出抗原修复良好，组织细胞形态保留良好的原始状态及其完整性，ck5/6阴性表达的细胞核苏木素染色清晰、明显，ck5/6阳性染色信号清晰、明确。该脱蜡修复液符合组织切片的免疫组化的脱蜡、水化、抗原修复的要求。
52.实施例三参照图1，一种用于石蜡组织切片脱蜡修复阻断的复合液配制方法，包括以下步骤：s1：制备水性脱蜡剂；s2：制备修复液；s3：制备内源性过氧化物酶阻断剂；s4：配置复合液。
53.本实施例中，所述s1中，所述水性脱蜡剂由水溶性脱蜡剂、组织渗透剂、分散剂、消泡剂和蒸馏水混合制备而成。
54.本实施例中，所述水溶性脱蜡剂由2.5%的peg200、0.5%的乙二醇和0.65%的脂肪醇聚氧乙烯醚混合组成；所述组织渗透剂由0.1%的triton x-100和0.25%的丙三醇混合组成。
55.本实施例中，所述分散剂为0.01%的tween-20；所述消泡剂为0.02%的乙二醇叔丁醚和0.05%的聚氧丙烯甘油醚。
56.本实施例中，所述s2中，所述修复液由缓冲液、组织渗透剂和金属螯合剂制备而成。
57.本实施例中，所述缓冲液为0.01mm的tris-hcl，且缓冲液的ph为9.0；所述金属螯合剂为0.001mm的edta；所述组织渗透剂由0.1%的triton x-100和0.25%的丙三醇混合组成。
58.配制操作步骤1：配制0.01mmtris-hcl（ph9.0）缓冲液，加入edta使其浓度达到0.001mm，即为抗原修复液。称取tris 1.21g与edta0.29g，溶解于1l蒸馏水中，充分溶解后，用盐酸调节ph值为9.0即可。
59.配制操作步骤2：依据以上组成比例，依次量取水溶性脱蜡剂（peg200、乙二醇、脂
肪醇聚氧乙烯醚）、渗透剂（triton x-100、丙三醇）、分散剂（tween-20）、消泡剂（乙二醇叔丁醚、聚氧丙烯甘油醚）加入到步骤1的抗原修复液中，充分搅拌溶解即可。
60.本实施例中，其脱蜡修复液在免疫组化实验中充当脱蜡剂的作用（含水化作用）：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤60分钟，然后将切片放入预先加热到75℃脱蜡修复液中，恒温浸泡20分钟；取出切片后再次直接放入另一缸预先加热到75℃脱蜡修复液中，恒温浸泡20分钟，然后用水冲洗即完成脱蜡并完成水化作用。脱蜡水化的病理切片、进行he染色、脱水、透明和封片。
61.参照图6，结果显示切片表面没有留蜡、脱蜡干净、组织细胞形态完整、染色清晰、明显、说明使用本试剂处理的病理切片具有良好的脱蜡效果，且不会损坏病理组织细胞结构。
62.本实施例中，其脱蜡修复液在免疫组化实验中脱蜡、水化、抗原修复作用：组织石蜡切片置于60-65℃烤箱中烤60分钟，然后将切片放入预先加热到75℃脱蜡修复液中，将脱蜡修复液继续加热到100℃，持续20分钟；取出切片后先用预先加热到75℃脱蜡修复液中漂洗一次，然后用水冲洗即完成脱蜡修复。
63.参照图7，p63在扁桃体组织上染色结果显示，切片表面的蜡没有明显的留存，脱蜡效果明显干净，经p63染色可以看出抗原修复良好，组织细胞形态保留良好的原始状态及其完整性，p63阴性表达的细胞核苏木素染色清晰、明显，p63阳性染色信号清晰、明确。该脱蜡修复液符合组织切片的免疫组化的脱蜡、水化、抗原修复的要求。
64.本发明的脱蜡修复阻断复合液，对石蜡组织切片预处理基本步骤为：加热脱蜡修复阻断复合液放入切片一次性完成脱蜡修复阻断作用，漂洗后即可进行抗原抗体免疫反应免疫组化染色。经过“四合一”脱蜡修复液处理，一次性完成脱蜡、水化、抗原修复及内源性过氧化物酶阻断的关键步骤，经试验验证其脱蜡水化修复阻断效果与经典的方法完全一致，可以在临床病理免疫组化检测应用。
65.本发明的脱蜡修复阻断复合液，将切片脱蜡、水化、抗原修复及阻断的操作步骤进行了整合，一步完成经典的三个步骤，其优点是：脱蜡修复阻断复合液无毒、不易挥发、操作过程不产生刺激性气味、生物降解性好，脱蜡效果与二甲苯相同等。
66.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。