一种稀释液以及钙卫蛋白校准品的制作方法

1.本发明涉及医学检测技术领域，具体而言，涉及一种稀释液以及钙卫蛋白校准品。


背景技术：

2.粪便钙卫蛋白（faecal calprotectin，fc）是一种分子量为36 kda的钙和锌的结合蛋白，是s100a8/a9结合蛋白基因的表达。其成分在中性粒细胞的细胞质所含比例最高，占30%~40%，是急性炎性细胞活化的标志物。其中，粪便钙卫蛋白定量检测成为炎症性肠病、肠癌等肠道器质性疾病的重要标志物。检测粪便中的钙卫蛋白可以区分炎症性肠病、结肠癌和肠易激综合征，并用来监测炎症性肠病的活动性，对疾病的复发、治疗效果具有重要指导意义。
3.钙卫蛋白是由两条分子量14 kd的重链（mrp14）和一条分子量为8kd的轻链（mrp8）以共价键连接而成的异聚体蛋白，每条链可以结合两个钙离子，在钙离子存在的情况下具有抗蛋白酶的活性，并因具有螯合锌离子的能力而具有抗热性，这些特性使得钙卫蛋白在肠腔和外界环境中可以长期保持稳定而不被各种酶和细菌破坏。钙卫蛋白在粪便中容易测得，且其成分稳定，但是脱离了粪便的环境，在一般的缓冲液中，钙卫蛋白稳定性较差。
4.目前，用于检测钙卫蛋白的方法主要是酶联免疫吸附试验（elisa）及胶体金免疫层析法和免疫比浊法等。检测时均需要性能稳定可靠的校准品进行校准，才能确保检测结果的准确性。而且，免疫学定量检测时需要检测到四聚体，确保检验结果的准确性。
5.天然蛋白提取价格昂贵，不适合工业化生产。现有技术大部分厂家采用钙卫蛋白重组蛋白制备校准品，但配置的校准品与粪便基质的区别导致检测结果偏差较大，另一方面，重组蛋白制备的校准品稳定性差，测值不准确。有厂家做成冻干粉的状态，于2-8℃的条件下保存，溶解后保持稳定性的时间仅1h，于15-30℃的条件下保存，溶解后保持稳定性的时间仅30min。保质期非常短，不适合实验室或医院定期校准使用。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种稀释液以及钙卫蛋白校准品。
8.本发明是这样实现的：第一方面，本发明实施例提供了一种稀释液，应用于配制钙卫蛋白校准品，所述稀释液包括以下组分：2g/l~50g/l的蛋白类物质、1g/l~20g/l的钙离子、0.1g/l~10g/l的锰离子或锌离子、质量体积比为0.01%~0.05%的防腐剂以及缓冲液。
9.第二方面，本发明实施例提供了一种钙卫蛋白校准品，其采用如前述实施例所述的稀释液稀释钙卫蛋白获得。
10.第三方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的稀释液在制备钙卫蛋白校准品中的应用。
11.第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的稀释液或如前述实施例所述
的钙卫蛋白校准品在检测钙卫蛋白中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
12.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种用于配制钙卫蛋白校准品的稀释液，一方面，其能够有效稳定的维持钙卫蛋白四聚体的空间结构，另一方面，将其应用于钙卫蛋白校准品的配制，能够显著提高钙卫蛋白的抗菌活性和耐热性，使得钙卫蛋白能够在缓冲液的环境中稳定长期地保存。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
14.图1为实施例2中的校准曲线；图2为实施例9的校准曲线；图3为实施例11的校准曲线；图4为实施例15的校准曲线；图5为对比例4的校准曲线；图6为对比例5的校准曲线；图7为对比例6的校准曲线；图8为实施例2的基质效应分析图；图9为实施例9的基质效应分析图；图10为实施例11的基质效应分析图；图11为实施例15的基质效应分析图；图12为对比例4的基质效应分析图；图13为对比例5的基质效应分析图；图14为对比例6的基质效应分析图；图8~14中，实线为临床样本测定的回归曲线，虚线为其预测值y的95%置信区间；
“□”
代表临床样本，“+”代表校准品，凡是落在虚线范围外的“+”，均判断为有基质效应。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
16.本发明实施例提供了一种稀释液，所述稀释液包括以下组分：2g/l~50g/l的蛋白类物质、1g/l~20g/l的钙离子、0.1g/l~10g/l的锰离子或锌离子、质量体积比为0.01%~0.05%的防腐剂以及缓冲液。
17.上述稀释液能够有效稳定的维持钙卫蛋白四聚体的空间结构，将其应用于钙卫蛋
白校准品的配制，能够显著提高钙卫蛋白的抗菌活性和耐热性，使得钙卫蛋白能够在缓冲液的环境中稳定长期地保存。
18.具体地，蛋白类物质在稀释液中的浓度可以在上述限定范围下任意选择，例如2g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l和50g/l中的任意一项或任意两项之间的范围。
19.钙离子在稀释液中的浓度可以在上述限定范围下任意选择，例如1g/l、5g/l、10g/l、15g/l和20g/l中的任意一项或任意两项之间的范围。钙卫蛋白是由s100a8(93个氨基酸，10.8 kda，α)和s100a9(114个氨基酸，13.2 kda，β)的异二聚体和四聚体。钙卫蛋白是否以αβ或α2β2的形式存在取决于钙离子。在没有钙离子的情况下，αβ二聚体占主导地位，而钙离子结合导致α2β2四聚体的形成，优选地，1.5g/l~2g/l的配比下，能够更好的促进α2β2四聚体的形成，提高钙卫蛋白的稳定性。
20.锰离子或锌离子的浓度可以在上述限定范围下任意选择，例如0.1g/l、0.5g/l、1g/l、1.5g/l、2.0g/l、2.5g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l、6g/l、6.5g/l、7g/l、7.5g/l、8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l和10g/l中的任意一项或任意两项之间的范围。钙卫蛋白螯合钙离子后，钙卫蛋白对锰和锌具有高亲和力，在本技术的特定配比下，结合锰和/或锌后，能够使得钙卫蛋白具有良好的抗菌活性。
21.在优选的实施方案中，所述稀释液包括以下组分：5g/l~20g/l的蛋白类物质、2g/l~3g/l的钙离子、0.5g/l~5g/l的锰离子或锌离子、质量体积比为0.01%~0.05%的防腐剂以及缓冲液。优选配比能够对应获得更好的技术效果。
22.在优选的实施方案中，所述缓冲液选自0.01m~0.5m tris-hcl缓冲液和0.01m~0.2m硼酸盐缓冲液中的任意一种。优选地，tris-hcl的终浓度可以在上述限定的范围下任意选择，例如0.01m、0.5m、1m、1.5m、2m、2.5m、3m、3.5m、4m、4.5m和5m中的任意一项或任意两项之间的范围。硼酸盐的终浓度可以在上述限定的范围下任意选择，例如0.01m、0.02m、0.04m、0.06m、0.08m、0.1m、0.12m、0.14m、0.16m、0.18m和0.2m中的任意一项或任意两项之间的范围。
23.在优选的实施方案中，所述缓冲液的ph为6~9，具体可以为6、7、8和9中的任意一项或任意两项之间的范围。
24.在优选的实施方案中，所述蛋白类物质选自血清白蛋白、小牛血清、胎牛血清和鸡卵白蛋白中的任意一种。
25.不对防腐剂的种类进行限定，在优选的实施方案中，所述防腐剂选自叠氮钠和proclin300中的任意一种。
26.本发明实施例提供了一种钙卫蛋白校准品，其包括采用如前述任意实施例所述的稀释液稀释钙卫蛋白获得。
27.本发明实施例提供了前述任意实施例所述的稀释液在制备钙卫蛋白校准品中的应用。
28.所述钙卫蛋白校准品由所述稀释液稀释钙卫蛋白获得。
29.可以理解的是，所述稀释液可以同前述任意实施例中的所述的稀释液，在此不再赘述。
30.本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的稀释液或如前述任意实施例所述
的钙卫蛋白校准品在检测钙卫蛋白中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
31.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
32.实施例1一种钙卫蛋白校准品，其由钙卫蛋白稀释液稀释重组钙卫蛋白获得，本实施例稀释得到5个浓度（20μg/ml、5μg/ml、1.2μg/ml、0.3μg/ml和0.1μg/ml）的钙卫蛋白校准品溶液，钙卫蛋白稀释液的组分及其配比如表1所示。
33.实施例2~实施例15，以及对比例1~8也提供了一种钙卫蛋白校准品，均与实施例1大致相同，区别在于钙卫蛋白稀释液的组分以及配比的不同，其组分及其配比如表1所示。
34.表1 钙卫蛋白稀释液
实施例缓冲液ph蛋白类物质钙离子锰/锌防腐剂实施例10.05mtris-hcl缓冲液8.5小牛血清0.5%氯化钙10g/l氯化锰0.5g/l叠氮钠0.03%实施例20.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l氯化锌5g/lp3000.04%实施例30.05m硼酸盐缓冲液8ova20g/l氯化钙5g/l氯化锌0.5g/lp3000.04%实施例40.05m磷酸盐缓冲液6.8bsa5g/l氯化钙0.5g/l氯化锰0.1g/l叠氮钠0.03%实施例50.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙1g/l氯化锌5g/lp3000.04%实施例60.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2g/l氯化锌5g/lp3000.04%实施例70.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙3g/l氯化锌5g/lp3000.04%实施例80.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l氯化锌1.5g/lp3000.04%实施例90.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l氯化锌2.5g/lp3000.04%实施例100.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l氯化锌7.5g/lp3000.04%实施例110.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l氯化锰2.5g/lp3000.04%实施例120.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l氯化锰5g/lp3000.04%实施例130.05m硼酸盐缓冲液7.4bsa40g/l氯化钙2.5g/l氯化锌5g/lp3000.04%实施例140.05m硼酸盐缓冲液7.4bsa5g/l氯化钙2.5g/l氯化锌5g/lp3000.04%实施例150.02m硼酸盐缓冲液7.4小牛血清1%氯化钙2.5g/l氯化锌5g/lp3000.04%对比例10.02m硼酸盐缓冲液8.5bsa20g/l//p3000.04%对比例20.02m磷酸盐缓冲液7ova10g/l//p3000.04%对比例30.05mtris-hcl缓冲液6.5bsa10g/l//p3000.04%对比例4生理盐水7小牛血清1%//叠氮钠0.03%对比例50.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l氯化铁5g/lp3000.04%对比例60.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l氯化钙2.5g/l/p3000.04%对比例70.02m硼酸盐缓冲液7.4bsa10g/l/氯化锌5g/lp3000.04%对比例80.02m硼酸盐缓冲液7.4/氯化钙2.5g/l氯化锌5g/lp3000.04%
试验例1：稳定性采用钙卫蛋白检测试剂盒（酶联免疫吸附法，铂尔曼）对制备的钙卫蛋白校准品进行实时稳定性、热稳定实验来评价实施例1~15以及对比例1~8的钙卫蛋白校准品的稳定性。
35.分别在校准品配置完成当天（0天）、2-8℃ 1个月、6个月、12个月、18个月、24个月及37℃放置3天、37℃7天、37℃14天，每次每个点平行检测3次，取平均值，与配制当天（0天）进行对比分析，计算相对偏差，相对偏差应不大于15%。
36.计算公式：相对偏差b（%）=（平均测值-第0天测值）/第0天测值
×
100%。
37.实施例1的校准品稳定性评价数据见表2。
38.表2 稳定性结果
实施例2的校准品稳定性评价数据见表3。
39.表3 稳定性结果实施例3的校准品稳定性评价数据见表4。
40.表4 稳定性结果
实施例4的校准品稳定性评价数据见表5。
41.表5 稳定性结果
实施例5的校准品稳定性评价数据见表6。
42.表6 稳定性结果
实施例6的校准品稳定性评价数据见表7。
43.表7 稳定性结果实施例7的校准品稳定性评价数据见表8。
44.表8 稳定性结果
实施例8的校准品稳定性评价数据见表9。
45.表9 稳定性结果实施例9的校准品稳定性评价数据见表10。
46.表10 稳定性结果
实施例10的校准品稳定性评价数据见表11。
47.表11 稳定性结果实施例11的校准品稳定性评价数据见表12。
48.表12 稳定性结果
实施例12的校准品稳定性评价数据见表13。
49.表13 稳定性结果实施例13的校准品稳定性评价数据见表14。
50.表14 稳定性结果
实施例14的校准品稳定性评价数据见表15。
51.表15 稳定性结果实施例15的校准品稳定性评价数据见表16。
52.表16 稳定性结果
对比例1的校准品稳定性评价数据见表17。
53.表17 稳定性结果对比例2的校准品稳定性评价数据见表18。
54.表18 稳定性结果
对比例3的校准品稳定性评价数据见表19。
55.表19 稳定性结果
对比例4的校准品稳定性评价数据见表20。
56.表20 稳定性结果对比例5的校准品稳定性评价数据见表21。
57.表21 稳定性结果
对比例6的校准品稳定性评价数据见表22。
58.表22 稳定性结果对比例7的校准品稳定性评价数据见表23。
59.表23 稳定性结果
对比例8的校准品稳定性评价数据见表24。
60.表24 稳定性结果以相对偏差-15%~15%的时间作为稳定时间对实验结果进行汇总分析如表25所示。
61.表25 稳定性试验结果汇总
表25（续） 稳定性试验结果汇总
由结果可知，实施例1、2、3、6、7、10、15中的校准品均可在4℃冷藏环境下稳定保存24个月，实施例4、5、8、9、11、12、13、14中的校准品均可在4℃冷藏环境下保存18个月。而对比例中仅对比例5中的校准品可在4℃冷藏环境下保存12个月，其余对比例中的校准品仅可在4℃冷藏环境下保存1-6个月不等。实施例提供的校准品稀释液中添加钙离子能更好的维持钙卫蛋白四聚体的空间结构，锰离子或锌离子可因其抗菌活性和耐热性可在缓冲液的环境中长期稳定保存。
62.试验例2：均一性对实施例2~3，对比例1~2的校准品，用钙卫蛋白检测试剂盒（酶联免疫吸附法，铂尔曼）进行均一性评价。
63.实验方案：对实施例2、3、6、9、11、13、15，对比例1、4、5、6、7、8得到的校准品，分别连续测定10次，按照计算平均值m和标准差sd，计算变异系数cv（瓶内），cv应≤5%。计算公式如下：cv(%)=sd/m
×
100%。
64.实施例2校准品的均一性实验结果见表26。
65.表26 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定119.651.220.280.078测定219.24.81.230.310.088测定319.64.61.280.290.079测定418.95.21.210.310.078测定5194.81.260.320.081测定619.64.91.230.290.084测定719.45.11.180.280.085
测定819.44.81.190.290.078测定919.64.91.230.290.087测定1019.65.11.150.290.081平均值19.394.921.220.300.08标准差0.26850.18140.03790.01350.0038变异系数cv1.4%3.7%3.1%4.6%4.7%实施例3校准品的均一性实验结果见表27。
66.表27 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定120.15.11.290.310.080测定219.951.220.320.079测定319.54.81.230.310.075测定419.95.11.280.290.079测定519.14.91.230.320.086测定619.65.11.190.290.083测定719.84.91.170.320.085测定819.45.11.210.290.076测定920.15.01.230.300.082测定1019.65.11.210.300.081平均值19.705.011.230.310.08标准差0.31970.11010.03660.01270.0036变异系数cv1.6%2.2%3.0%4.2%4.4%实施例6校准品的均一性实验结果见表28。
67.表28 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定118.95.11.290.310.085测定219.75.21.220.330.089测定319.45.51.230.310.086测定419.15.11.280.320.093测定5205.21.230.30.089测定6205.51.190.330.086测定719.25.31.170.320.088测定820.95.11.210.320.092测定919.45.21.230.310.087测定1019.65.31.210.320.091平均值19.625.251.230.320.09标准差0.57700.15090.03660.00950.0027变异系数cv2.9%2.9%3.0%3.0%3.1%实施例9校准品的均一性实验结果见表29。
68.表29 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定120.15.31.290.310.089测定219.551.230.290.088测定320.45.11.160.310.092测定421.15.21.260.320.092测定520.35.31.330.290.096测定619.151.210.310.094测定720.651.250.290.093测定820.55.11.270.310.089测定920.55.21.230.320.089测定1020.84.91.240.310.091平均值20.295.111.250.310.09标准差0.59530.13700.04600.01170.0026变异系数cv2.9%2.7%3.7%3.8%2.8%实施例11校准品的均一性实验结果见表30。
69.表30 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定120.65.11.220.280.096测定221.44.71.250.290.088测定319.65.11.220.320.092测定419.951.270.310.093测定521.45.11.240.310.088测定621.24.91.290.290.087测定719.74.71.210.310.089测定820.95.11.350.30.087测定921.14.91.230.300.094测定1019.651.210.300.094平均值20.544.961.250.300.09标准差0.76330.15780.04410.01200.0034变异系数cv3.7%3.2%3.5%4.0%3.7%实施例13校准品的均一性实验结果见表31。
70.表31 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定119.84.81.210.30.083测定220.64.81.280.290.092测定319.851.250.310.088测定420.85.11.230.30.089测定519.55.11.150.290.089
测定619.85.21.210.310.087测定720.251.230.290.092测定819.75.11.240.290.092测定9215.01.210.280.087测定1019.94.81.210.300.094平均值20.114.991.220.300.09标准差0.51520.14490.03390.00970.0033变异系数cv2.6%2.9%2.8%3.3%3.7%实施例15校准品的均一性实验结果见表32。
71.表32 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定119.751.320.30.077测定219.74.91.210.30.077测定319.15.21.30.290.077测定420.55.21.240.290.085测定521.84.91.290.320.081测定620.55.31.280.290.082测定720.85.31.220.290.073测定819.64.71.170.310.079测定919.85.01.230.290.077测定1019.65.11.210.300.081平均值20.115.061.250.300.08标准差0.78940.19550.04810.01030.0034变异系数cv3.9%3.9%3.9%3.5%4.3%对比例1校准品的均一性实验结果见表33。
72.表33 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定119.651.250.290.085测定219.95.21.230.310.079测定321.25.11.190.290.089测定4214.91.250.280.082测定521.64.81.190.320.083测定620.25.11.320.290.075测定720.64.91.350.310.086测定8194.71.290.290.08测定9205.21.260.280.076测定1019.64.81.150.310.084平均值20.274.971.250.300.081标准差0.81660.17670.06160.01420.0044
变异系数cv4.0%3.6%4.9%4.8%5.5%对比例4校准品的均一性实验结果见表34。
73.表34 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定119.651.230.280.088测定219.74.81.230.310.085测定320.64.71.240.310.092测定418.35.21.240.290.086测定519.44.61.140.290.087测定620.55.11.230.310.084测定719.251.230.290.089测定819.54.91.150.280.096测定919.14.91.340.320.086测定1020.34.81.150.310.081平均值19.624.901.220.300.09标准差0.70360.18260.05940.01450.0042变异系数cv3.6%3.7%4.9%4.8%4.8%对比例5校准品的均一性实验结果见表35。
74.表35 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定120.55.11.250.330.076测定219.85.11.170.310.087测定321.44.91.270.310.078测定421.24.61.190.320.081测定519.75.21.140.330.086测定621.24.61.160.310.087测定719.84.71.170.320.077测定821.14.91.120.30.078测定919.74.91.110.290.076测定1018.34.91.240.320.084平均值20.274.891.180.310.081标准差0.98440.20790.05510.01260.0046变异系数cv4.9%4.3%4.7%4.0%5.7%对比例6校准品的均一性实验结果见表36。
75.表36 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定121.35.11.260.310.093测定218.95.41.310.320.098测定318.65.11.230.320.097
测定4204.91.210.30.095测定519.75.21.210.290.092测定620.15.51.220.320.096测定719.65.11.320.330.093测定819.65.31.270.320.097测定920.151.260.310.095测定1020.24.81.250.330.086平均值19.815.141.250.320.081标准差0.74300.21710.03860.01270.0035变异系数cv3.8%4.2%3.1%4.0%4.3%对比例7校准品的均一性实验结果见表37。
76.表37均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定119.751.190.320.085测定219.24.51.240.320.082测定320.851.190.310.081测定419.14.81.230.280.084测定518.64.61.210.290.085测定618.851.170.30.081测定718.95.11.270.310.079测定820.85.31.250.290.075测定918.351.320.310.076测定1019.64.81.210.310.084平均值19.384.911.230.300.081标准差0.85870.23780.04440.01350.0036变异系数cv4.4%4.8%3.6%4.4%4.4%对比例8校准品的均一性实验结果见表38。
77.表38 均一性实验结果测值20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml测定119.14.71.340.290.087测定221.34.91.300.330.085测定319.55.11.220.310.079测定418.95.31.270.30.086测定521.85.11.190.270.077测定620.55.31.170.290.082测定719.75.51.220.330.073测定820.35.31.360.280.078测定920.54.91.320.310.073测定1019.74.91.210.310.088
平均值20.135.101.260.300.081标准差0.93100.24940.06700.01990.0056变异系数cv4.6%4.9%5.3%6.6%6.9%实验结果汇总如表39所示。
78.表39 均一性实验结果汇总浓度20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml实施例21.4%3.7%3.1%4.6%4.7%实施例31.6%2.2%3.0%4.2%4.4%实施例62.9%2.9%3.0%3.0%3.1%实施例92.9%2.7%3.7%3.8%2.8%实施例113.7%3.2%3.5%4.0%3.7%实施例132.6%2.9%2.8%3.3%3.7%实施例153.9%3.9%3.9%3.5%4.3%对比例14.0%3.6%4.9%4.8%5.5%对比例43.6%3.7%4.9%4.8%4.8%对比例54.9%4.3%4.7%4.0%5.7%对比例63.8%4.2%3.1%4.0%4.3%对比例74.4%4.8%3.6%4.4%4.4%对比例84.6%4.9%5.3%6.6%6.9%由结果可知，实施例2、3、6、9、11、13、15及对比例4、6、7均一性较好，cv均＜5%，对比例1和对比例5仅最低值0.1μg/ml的均一性稍差（cv5.5%），其余4个点校准品均一性较好。分析原因可能为几种校准品稀释液中均含有不同浓度的蛋白，蛋白类物质对蛋白有一定的保护作用，对比例8缺少蛋白类保护，均一性稍差。实施例2、3、6、9、11、13、15中均含有蛋白及含钙离子及锌（锰）离子，对比例4中含钠离子，均有一定的离子浓度，对钙卫蛋白的均一性起到正向的作用。
79.试验例3：基质效应采用实施例2、9、11、15的校准品及对比例4、5、6的校准品应用于钙卫蛋白检测试剂盒（胶体金法或免疫比浊法）。并对校准品的基质效应进行评估。
80.以钙卫蛋白检测试剂盒（胶体金法）对校准品进行检测，每个点平行测定5次制备校准曲线，校准品浓度为10μg/ml、5μg/ml、1.2μg/ml、0.3μg/ml和0.1μg/ml，根据样本稀释倍数，样本的检测范围为2000μg/g、1000μg/g、240μg/g、60μg/g和20μg/g。拟合r2均＞0.99。校准曲线如图1~图7所示。
81.参考wst356-2011对制备的校准品进行基质效应评价：对临床样本和制备的校准品进行分析，利用试剂盒原曲线测值为比对方法，制备的校准品的新曲线测值为评估方法，测定临床样品的结果建立数学关系（回归）。制备样品测定的结果偏离这一数学关系的程度即反映其基质效应的大小。将制备校准品与20份新鲜临床样品随机穿插排列，分别使用评估方法与比对方法测定所有样品，重复测定3次，每次测定都需校准，评估方法与比对方法宜同步进行。
82.利用新鲜临床样品及制备样品重复测定结果的均值（使用不同符号）作散点图。y
轴为评估方法结果，x轴为对比方法结果。
83.根据以下公式计算给定x值下（重复测量均值），新鲜临床样本评估方法测定均值y的双侧95%置信区间。
84.；式中：——根据回归曲线，计算出来的在值的值；——新鲜患者样本数量；——常数项，线性回归时为2，二次回归时为3；——回归标准误，计算公式为：；——x轴上第个值（某样本比对方法测定均值）；——y轴上第个值（某样本评估方法测定均值）；——所有样本比对方法测定均值的整体均值。
85.利用以上方程，将比对方法测定均值作为x轴，计算每个制备样本的y值的95%置信区间，如果评估方法的测定均值落在该区间内，说明该制备样本对评估方法无基质效应，表明该物质在比对方法和评估方法间具有互通性。需要注意的是，若两种测定方法间的特异性差异较大，测定结果间的相关性将会受到影响，从而导致计算出来的置信区间偏大，以至于无法检出不太显著的基质效应，影响最终的结论。
86.在散点图上，将一系列临床样本的比对方法测定的均值（x）与对应的y值的95%预测区间在回归线两边标记出来。若制备样品的点落在预测区间线条之外则说明存在基质效应。若制备样品的点在置信区间内，则表明不存在基质效应。
87.实施例2的钙卫蛋白校准品的评估结果见表40、表41和图8。
88.表40 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表40（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表41 实施例2的钙卫蛋白校准品基质效应评估实施例9的钙卫蛋白校准品的评估结果见表42、表43和图9。
89.表42 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表42（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表42（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表43 实施例9的钙卫蛋白校准品基质效应评估
实施例11的钙卫蛋白校准品的评估结果见表44、表45和图10。
90.表44 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表44（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表45 实施例11的钙卫蛋白校准品基质效应评估
实施例15的钙卫蛋白校准品的评估结果见表46、表47和图11。
91.表46 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表46（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表46（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表46（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表47 实施例15的钙卫蛋白校准品基质效应评估对比例4的钙卫蛋白校准品的评估结果见表48、表49和图12。
92.表48 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表48（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表49 对比例4的钙卫蛋白校准品基质效应评估对比例5的钙卫蛋白校准品的评估结果见表50、表51和图13。
93.表50 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表50（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表50（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表51 对比例5的钙卫蛋白校准品基质效应评估对比例6的钙卫蛋白校准品的评估结果见表52、表53和图14。
94.表52 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表52（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表表52（续） 钙卫蛋白校准品基质效应评估结果-直线回归数据分析表
表53 对比例6的钙卫蛋白校准品基质效应评估实验结果汇总如表54所示。
95.表54 基质效应实验结果汇总校准品20μg/ml5μg/ml1.2μg/ml0.3μg/ml0.1μg/ml拟合r2实施例2无无无无无0.9996实施例9无无无无无0.9974实施例11无无无无无0.9939实施例15无无无无无0.9974对比例4负负负正无0.9991对比例5正无负无无0.9989对比例6无无无无无0.9966表中：无：无基质效应；正：正基质效应；负：负基质效应。
96.结果可知，实施例2、9、11、15及对比例6制备的钙卫蛋白校准品，经验证无基质效应，可较好地用于钙卫蛋白检测试剂盒（不同检测系统）的校准及验证。对比例5可能由于氯化铁的存在导致有两个校准品有基质效应，而对比例4仅含有小牛血清，成分过于单一导致四个校准品有基质效应。
97.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。