分子筛串联固相萃取检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的方法与流程

1.本发明涉及的是一种固相萃取检测方法，特别是一种分子筛串联固相萃取检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的方法，属于分析化学技术领域。


背景技术：

2.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是世界农药界继三唑类杀菌剂之后的又一类极具发展潜力和市场活力的新型农用杀菌剂，是化学保护性杀菌剂中持效期最长的成分。该类杀菌剂具有保护、治疗、铲除、渗透作用，无致癌和致突变等特点能有效防治子囊菌、担子菌、半知菌和卵菌等真菌引起的病害，内吸活性好，杀菌谱广，对几乎所有真菌性病害均有防治效果，除杀菌活性外也具有一定的生长调节作用，具有广谱杀菌性、毒性小的优点，由于独特的作用机制、高度的环境安全与超高活性使其开发前景广阔，是目前农药市场上最受欢迎的一类杀菌剂。但随着甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在农作物上的应用范围越来越广，用量也日益增多，杀菌剂不同成分的安全性也存在较大差别，此类杀菌剂在谷物等农作物和环境中的残留风险将会对人体健康造成潜在的危害。
3.国内检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的相关的研究报道较少，目前采用的前处理方法主要包括固相萃取法、快速溶剂萃取、固相微萃取法、quechers方法等，主要的仪器方法包括气相色谱法(gc)、气相色谱质谱法(gc-ms)、气相色谱串联质谱法(gc-ms/ms)、液相色谱法(lc)、液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)等。然而上述前处理方法对谷物和土壤样品等不同基质中的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂进行检测分析时快速溶剂法试剂消耗多， quechers虽然操作简便但是提取效率低，固相微萃取法在方法的稳定性比较差，因此建立一种快速、高效、灵敏的同时检测不同基质中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检测方案体系十分有必要。固相萃取法具有回收率高、性能稳定等优点，本发明首次将氨基化的sba-15介孔分子筛作为固相萃取柱填充材料对复杂基质进行净化与gc-ms/ms联用检测8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的含量。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的检测方法存在的上述问题，提出一种基于氨基功能化sba-15分子筛与psa材料的串联固相萃取方法进行前处理，再通过gc-ms/ms法进行检测分析，建立谷物和土壤样品不同基质中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的检测方法。
5.本发明的技术解决方案：一种分子筛串联固相萃取检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的方法，具体包括如下步骤：1)氨基功能化sba-15分子筛粉末的合成取一圆底蒸馏烧瓶，称取5g sba-15分子筛粉末放入其中，加入100ml甲苯，搅拌30min；逐滴加入20ml 3-氨丙基三乙基硅烷，在恒温磁力搅拌器中，于110℃条件下搅拌回流6h，再于室温条件下搅拌12h；然后用无水乙醇多次洗涤，过滤得到白色粉末，再于65℃条
件下真空干燥12h，即得到氨基功能化sba-15分子筛粉末。
6.2)串联固相萃取柱的制备以2个1ml聚丙烯固相萃取柱上下串联作为净化装置，在下层固相萃取柱中填装100mg psa 粉末，上层固相萃取柱中填装300mg步骤1)制备的氨基功能化sba-15分子筛粉末，上下层均用1ml疏水性筛板进行固定压实。
7.3)样品采集和预处理从不同区域的水稻种植地分别采集40份刚成熟的稻米以及对应的土壤样品，每份样品采集不少于500g；称取混匀的稻米样品100g，由脱壳机脱壳后研磨过筛备用，于-20℃冰箱保存；土壤研磨过筛备用，于-20℃冰箱保存。
8.称取10g研磨好的稻米或土壤样品于50ml离心管中，加入15ml乙腈，5g nacl，超声提取20min，8000r/min冷冻离心5min，转移上清液于氮吹瓶中，再加入10ml乙腈重复提取一次，合并上清液，于40℃氮吹仪中氮吹浓缩至近干，用2ml 1:1的环己烷-乙酸乙酯溶液复溶，待净化；用3ml 1:1的环己烷-乙酸乙酯溶液活化步骤2)制作的串联固相萃取柱，上样，收集滤液，再用5ml 1:1环己烷-乙酸乙酯溶液多次洗脱，收集洗脱液于氮吹管，浓缩，并用1ml环己烷-乙酸乙酯溶液定容，过0.22um ptfe滤膜，待测。
9.4)气相色谱串联质谱法检测样品气相条件具体如下：进样口300℃，不分流进样，高压进样，进样时间1min，流量控制方式为线速度，线速度为40.2cm/sec，柱流速为1.2ml/min；rtx-5ms色谱柱70℃保持1min，以15℃/min升至280℃保持2min，再以30℃/min升至300℃保持10min，进样量1ul。
10.质谱条件具体如下：ei离子源230℃，接口温度280℃，溶剂延迟3min，检测器电压相对于调谐电压0.6kv，分时段多反应选择监测模式。
11.与现有技术相比，本发明的优点在于：1)该方法首次将氨基化sba-15与psa粉末进行串联固相萃取的应用，为实验室检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留提供方法参考，为农产品的安全生产和消费，以及最大残留限量的制定和修订提供重要的理论依据，为该类农药的安全使用和在环境中的残留情况提供借鉴； 2)该方法具有操作简单快捷，试剂消耗少，净化效果好，方法灵敏度高等优点，适用于复杂基质样品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的检测分析。
附图说明
12.附图1是本发明实施例中串联固相萃取柱的结构示意图。
13.附图2是8种甲氧丙烯酸酯杀菌剂的mrm质谱图。
14.附图3是氨基sba-15的质量对加标回收率的影响折线图。
15.附图4是psa的质量对加标回收率的影响折线图。
具体实施方式
16.下面结合附图进一步说明本发明的技术方案。所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明
的限制。
17.下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同结构。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的实施步骤进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本发明提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
18.在本说明书的描述中，参考术语“本实施例”“示例”“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合所述实施方式或示例描述的具体特征结构材料或者特点包含于本发明的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征结构材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
19.本实施例中提出一种分子筛串联固相萃取检测甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的方法，具体操作步骤如下：1)仪器和试剂本实施例中使用的仪器型号和试剂类型具体如下：仪器：tq-8040气质谱联用仪(日本，岛津公司)；rtx-5ms色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μ m)；全自动氮吹仪(美国，horizon)；恒温超声仪(江苏，昆山市超声仪器有限公司)；冷冻离心机(美国，thermoscientific)；vortex1漩涡混匀器(德国艾卡)，df-101s恒温磁力搅拌器(上海力辰邦西仪器科技有限公司，上海)，1ml的串联固相萃取空柱及其配件 (杭州微米派科技有限公司，杭州)。
20.试剂：丙酮、环己烷、氯化钠、乙腈、乙酸乙酯(以上试剂均为分析纯，购于德国默克)，3-氨丙基三乙基硅烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)、sba-15介孔分子筛材料(先丰纳米材料有限公司，南京)，psa(n-丙基乙二胺)固相吸附剂粉末(粒径为40μm-60μm，天津博纳艾杰尔公司)。
21.8种常用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的样品，包括：啶氧菌酯、e-苯氧菌胺、醚菌酯、醚菌胺、嘧螨酯、肟菌酯、氟嘧菌酯、嘧菌酯，均为浓度1000mg/ml的标准溶液，由丙酮稀释成浓度为1000mg/l的标准混合储备溶液，用基质逐级稀释，配置成氟嘧菌酯、嘧菌酯浓度为50、100、500、1000、2000、4000μg/l和其他组分浓度为25、50、100、250、500、 1000、2000μg/l的混合标准系列。8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的相关物理化学参数见表 1。
22.表1 8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的物理化学性质表
2)氨基功能化sba-15分子筛粉末的合成及其固相萃取柱的制备取一圆底蒸馏烧瓶，称取5g sba-15分子筛粉末放入其中，加入100ml甲苯，搅拌30min；逐滴加入20ml 3-氨丙基三乙基硅烷(aptes)，在恒温磁力搅拌器在110℃下，搅拌回流 6h，在室温条件下搅拌12h，然后用无水乙醇多次洗涤，过滤得到白色粉末，然后进行真空干燥(65℃，12h)，即得到氨基功能化sba-15分子筛粉末。
23.以2个1ml聚丙烯为材料的固相萃取柱上下串联作为净化装置，固相萃取柱上端为鲁尔母口，下端为鲁尔公口，在下层固相萃取柱中填装100mg psa粉末，上层固相萃取柱中填装300mg氨基功能化sba-15分子筛粉末，上下层均用1ml疏水性筛板进行固定压实，方便正压净化。该串联固相萃取柱的结构如图1所示。
24.3)样品采集和处理从不同区域的水稻种植地分别采集40份刚成熟的稻米以及对应的土壤样品，每份样品采集不少于500g。其中称取混匀的100g稻米样品由脱壳机脱壳后研磨过筛备用，于-20℃冰箱保存；土壤研磨过筛备用，于-20℃冰箱保存。
25.称取10g研磨好的稻米或土壤样品于50ml离心管中，加入15ml乙腈，5g nacl超声提取20min，8000r/min冷冻离心5min，转移上清液于氮吹瓶中，再加入10ml乙腈重复提取一
次，合并上清液，40℃氮吹仪中氮吹浓缩至近干，用2ml 1:1的环己烷-乙酸乙酯溶液复溶，待净化。
26.用3ml 1:1的环己烷-乙酸乙酯溶液活化步骤2)制作的串联固相萃取柱，上样，收集滤液，再用5ml 1:1环己烷-乙酸乙酯溶液多次洗脱，收集洗脱液于氮吹管，浓缩，并用1 ml环己烷-乙酸乙酯溶液定容，过0.22um ptfe滤膜，待测。
27.4)气相色谱串联质谱法(gc-ms/ms)检测气相条件：进样口300℃，不分流进样，高压进样，进样时间1min，流量控制方式为线速度，线速度为40.2cm/sec，柱流速为1.2ml/min；rtx-5ms色谱柱70℃保持1min，以15℃ /min升至280℃保持2min，再以30℃/min升至300℃保持10min，进样量1ul质谱条件：ei离子源230℃，接口温度280℃，溶剂延迟3min，检测器电压相对于调谐电压 0.6kv，分时段多反应选择监测模式(mrm)。考虑各项条件对检测结果的影响，本实施例中对检测方法涉及的气相色谱-质谱条件、净化条件和基质效应进行了优化，确定了最佳的实验条件，并计算了方法的线性和检出限，以及回收率和精密度，再经过实际样品检测以验证检测效果。
28.一、气相色谱-质谱条件优化在电子轰击离子源为ei源的模式下对8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂进行总离子流图扫描，分别找到8种甲氧基丙烯酸酯类化合物的前体离子，设定3～45ev的碰撞能量，对选定的前体离子进行产物离子扫描，根据二级质谱选择合适的定量离子和定性离子对，相关检测参数和优化条件见表2，优化的8种甲氧丙烯酸酯杀菌剂的mrm质谱图见图2所示，图中1～8 分别表示表2中序号对应的化合物。
29.表2 8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的质谱检测参数表二、净化条件优化sba-15介孔分子筛具有比表面积高、主孔道尺寸均一、孔壁厚、孔径大等优点，在吸附和分离、生物和纳米材料等领域具有潜在的应用前景。本实施例中将sba-15氨基化，兼具有纳米分子筛的高吸附性能，又具有氨基基团的去杂质能力，从而对甲氧基丙烯酸酯类
化合物具有更强吸附和和净化能力；其中psa可以有效去除谷物和土壤中的脂肪酸、有机酸、极性色素和糖类等干扰物，故氨基化sba-15和psa的用量成为提高回收率和去除基质干扰的关键。
30.所以综合两种材料对谷物和土壤基质进行净化时，分别对氨基化sba-15和psa的加入量进行单因素实验，以空白基质加标回收率为指标，选择两者最佳使用量，以氨基功能化 sba-15和psa的用量为横坐标，回收率为纵坐标绘制折线图，如图3和图4所示；由图可知，当氨基sba-15加入量为300mg，psa的加入量为100mg时，稻米和土壤中8种杀菌剂的回收率较好。
31.三、基质效应基质效应(matrix effect，me)指样品处理过程中除目标化合物外，其他组分对定量分析准确性和重现性的影响。me采用公式(1)计算：式中km为基质匹配校准曲线的斜率，k为溶剂校准曲线的斜率。
32.参照步骤3)样品采集和处理过程提取空白稻米和土壤基质溶液。分别用丙酮和空白基质溶液配制相同浓度的工作液，按步骤4)气相色谱串联质谱法的检测条件进行分析测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制基质匹配校准曲线和溶剂校准曲线，并计算基质效应，最终算得me值为1.21～1.89，表明存在基质效应。因此，采用基质匹配校准曲线外标法对样品进行定量分析，以减少基质效应对实验结果的影响。
33.四、方法的线性和检出限计算以稻米和土壤空白基质配置8种甲氧丙烯酸酯类化合物的标准系列，在最佳实验条件下测定 6次，取平均值做标准曲线；当氟醚菌酯和嘧菌酯浓度范围在50～4000μg/l，和其他组分浓度范围在25～2000μg/l内时，以化合物的浓度(μg/l)为横坐标，以目标化合物的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算相关系数和线性范围。经过计算，8种化合物的线性关系良好，相关系数在0.9969-0.9998范围内。根据最低标准浓度的3倍信噪比(s/n)计算本法的最低检出限，8种化合物的最低检出限在1.0～3.5μg/kg范围内，如表3所示。
34.表3线性系数、检出限和定量限
化合物线性方程相关系数(r)线性范围(μg/l)检出限(μg/kg)定量限(μg/kg)啶氧菌酯y＝67.24x+1213.70.999225-20002.06e-苯氧菌胺y＝41.90x-188.90.999725-20002.57.5醚菌酯y＝38.10x+649.90.999625-20002.06嘧螨酯y＝169.6x-108.40.999325-20001.03肟菌酯y＝19.28x-88.30.999525-20002.57.5醚菌胺y＝188.9x-17310.999825-20001.03氟醚菌胺y＝15.6x+295.40.998450-40003.510嘧菌酯y＝14.46x-790.80.996950-40003.510
五、方法的回收率和精密度计算取未检出8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的稻米和土壤样品，除分别配成10、50、100μg/kg 三种不同加标水平的样品，参照步骤3)样品采集和处理过程进行处理，每个水平进行6次平行实验，计算回收率和精密度，最终算得回收率在71.0％～102％之间，rsd在
1.99％～4.98％之间，准确度和精密度良好，可以满足谷物和土壤样品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂含量的检测分析。加标回收率和精密度实验结果如表4所示。
35.表4加标回收率和精密度实验(n＝6)六、实际样品检测应用所建立的方法对采集的40份稻米和土壤样品进行检测，其中稻米中检出氟醚菌酯8份，含量范围在0.021-0.133mg/kg范围内；检出肟菌酯1份，含量为0.035mg/kg；土壤样品中检出氟醚菌酯5份含量在0.014-0.089mg/kg，啶氧菌酯2份分别为0.045mg/kg和0.018 mg/kg。
36.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。