一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法与流程

1.本发明涉及药品检测技术领域，尤其涉及一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法。


背景技术：

2.沃尼妙林(valnemulin)和泰妙菌素(tiamulin)均属于截短侧耳素衍生物类抗生素，沃尼妙林与泰妙菌素属同一类药物，是新一代截短侧耳素类半合成抗生素，在实际应用中，通常用到的是沃尼妙林的盐酸盐和泰妙菌素的延胡索酸盐。沃尼妙林和泰妙菌素均具有广谱抗菌性，该类抗生素通过抑制菌体蛋白的合成对革兰氏阳性菌及支原体起抗菌作用，可以有效杀灭各种细菌、链球菌以及支原体，具有抗菌活性强、治疗效果显著、休药期短和使用安全性高等特点。目前被广泛用于猪痢疾、回肠炎、大肠炎及肺炎的治疗及预防，且仅作为畜禽类用药。
3.作为两种典型的兽用抗生素，同其他兽用抗生素一样，沃尼妙林和泰妙菌素在发挥其功效的同时也不可避免的带来了兽药残留的负面影响。众所周知，兽用抗生素的使用往往是专用的，即将某些抗生素专作为动物用药，而人类常用的抗生素也避免在兽药中出现，其目的就是为了防止抗生素滥用带来的一系列严重后果甚至于灾难。抗生素类兽药残留的危害主要有以下几个方面：
4.1.抗生素对动物的危害主要表现在其对动物自身免疫力的破坏上，与人体用药不同，动物用药常常是预防性用药，持续时间长，用药量大。大量的抗生素进入动物体内后，随血液循环迅速到达各主要脏器，打破动物体内正常菌群平衡，引起菌群失调，免疫力下降，进而造成各种内源性和外源性细菌的感染，从而危害动物健康，影响动物源性食品的食用安全和畜牧业的发展。
5.2.抗生素残留对人体的危害。由于人类食用动物源性食品，动物体内残留的抗生素就不可避免的随肉、蛋、奶等制品进入人体，从而造成一系列直接和间接的危害：1)毒性作用；人食用含有抗生素残留的动物源性食品后，将分布于动物组织中的残留药物分子、代谢产物及其他中间产物一同摄入体内，根据残留剂量及其特性的不同，往往会诱发各种急慢性中毒及变态反应。尽管动物毒理学实验表明，沃尼妙林和泰妙菌素毒性均较低，但鉴于其通过食物链进入人体的复杂途径及富集效应，尤其是考虑长期暴露的危害，仍不能轻视其在动物源性食品中残留会对人体造成的危害。2)破坏人体正常菌落平衡；人体消化道内存在着大量的有益菌群，这些有益菌能产生人体必需的微生物，通过合成各种非必需氨基酸参与蛋白质、糖类的代谢，还可以促进微量矿物元素的吸收，抗生素的不当摄入，往往会导致消化道内敏感菌的生长活动受到抑制，人为的造成抗药性菌株的生长优势，打破原有平衡，造成机体代谢的紊乱和一系列不良症状，危害人体健康。3)产生耐药性病原菌；长期亚剂量的抗生素的摄入，往往会导致人体耐药菌株的产生。这些耐药菌株的产生将直接威胁着人体健康。另一方面，已有实验证据表明动物体内的耐药菌质粒可以向人体直接传播。
而这些耐药菌在人体消化道微环境中长期存在繁殖，又可以通过转化等各种途径将抗药基因传递致病菌，从而产生各种危害性更大的超级病原菌。
6.近年来，随着养殖业的迅速发展，一些不法分子在经济利益的驱动下，置法律法规于不顾，为达到保活、保重以及增加捕获量的目的，擅自在兽药制剂中非法添加泰妙菌素和沃尼妙林，导致该药物在产品中的残留，给食品安全带来严重隐患。
7.目前，国内外对泰妙菌素和沃尼妙林这两种抗生素的检测方法主要有气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)和高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)等。现有技术中仅有对饲料、食品和出口活鱼中沃尼妙林和泰妙菌素残留的检测方法，而兽药制剂中检测方法的缺乏造成了药品安全监测的盲区。为及时排除安全隐患、保证兽药用药的质量安全，需要建立一种简单、快速准确的测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林残留的方法，对规范兽药制剂产业，保证用药质量安全，维护人民生命健康，扩大对外贸易，加强兽药制剂的安全检测监督具有十分重要的意义。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法，可以简单、快速准确的测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林的残留量。
9.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
10.本发明提供了一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法，包括以下步骤：
11.1)配制标准工作液
12.分别将泰妙菌素、沃尼妙林和溶剂混合，配制泰妙菌素和沃尼妙林的标准工作液；
13.2)样品预处理
14.将样品和溶剂混合后离心，得到提取液过萃取柱，并顺次以甲酸水溶液和甲醇淋洗，弃去流出液；再用氨水-甲醇混合溶液洗脱萃取柱，收集洗脱液过0.22μm滤膜，得到样品溶液；
15.3)样品的检测
16.将步骤2)得到的样品溶液进行色谱分离和质谱检测，得到样品中泰妙菌素和沃尼妙林的含量。
17.进一步的，所述色谱分离的条件为：
18.色谱柱：c
18
柱，2.0
×
150mm，粒径5μm；
19.流动相包含流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为0.05～0.15％的甲酸水溶液，流动相b为乙腈；
20.流动相的流速：0.2～0.4ml/min；
21.进样量：1～3μl。
22.进一步的，所述色谱分离的过程中采用多梯度淋洗，所述多梯度淋洗为：0～1min时，淋洗液为体积比为2：8的流动相a和流动相b；1～3min时，淋洗液为体积比为4：6的流动相a和流动相b；3～9min时，淋洗液为体积比为2：8的流动相a和流动相b。
23.进一步的，所述质谱检测的条件为：
24.离子源：电喷雾离子源；
25.毛细管电压：4000v；
26.干燥气流速：10l/min；
27.雾化气压力：0.1mpa；
28.喷嘴电压：1500v；
29.干燥气温度：500℃。
30.进一步的，所述泰妙菌素和沃尼妙林的标准工作液的浓度分别独立的为1μg/l、2μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l、50μg/l和100μg/l。
31.进一步的，所述步骤2)中，洗脱液需要用30～45℃的氮气吹干并加入1～2ml的乙腈溶解后再过0.22μm滤膜。
32.进一步的，所述甲酸水溶液的体积浓度为0.05～0.15％。
33.进一步的，所述氨水-甲醇混合溶液的体积浓度为4～6％，所述氨水和甲醇的体积比为1：0.5～1.5。
34.本发明的有益效果：
35.本发明建立了液相色谱-质谱/质谱法测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法。通过对各项参数的限定，找出了最佳净化方法，使仪器检测灵敏度达到最优化。该技术操作简单、快速，提高了工作效率。该方法的建立为分析动物源食品中安乃近代谢物的残留提供了新的技术手段。
36.检测结果表明：泰妙菌素和沃尼妙林化合物在1.0～100ng/ml范围内线性关系良好，相关系数(r)大于0.999，方法的检出限(lod)为0.05mg/kg，定量限(loq)为0.1mg/kg。所有化合物在3个添加水平(0.1、0.2和1.0mg/kg)下，方法回收率在80.5～107.1％，精密度范围为4.77～11.1％，该方法简单、快速、准确，可实现兽药制剂的快速测定。
附图说明
37.图1为泰妙菌素和沃尼妙林混合标准溶液的mrm色谱图(10ng/ml)；
38.图2为不同样品中泰妙菌素和沃尼妙林的基质效应图，其中1为桑仁清肺口服液、2为杨树花口服液、3为板蓝根注射液、4为鱼腥草注射液、5为黄花白莲颗粒、6为金黄连板颗粒；
39.图3为泰妙菌素的液相色谱-质谱/质谱线性关系图；
40.图4为沃尼妙林的液相色谱-质谱/质谱线性关系图。
具体实施方式
41.本发明提供了一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法，包括以下步骤：
42.1)配制标准工作液
43.分别将泰妙菌素、沃尼妙林和溶剂混合，配制泰妙菌素和沃尼妙林的标准工作液；
44.2)样品预处理
45.将样品和溶剂混合后离心，得到提取液过萃取柱，并顺次以甲酸水溶液和甲醇淋洗，弃去流出液；再用氨水-甲醇混合溶液洗脱萃取柱，收集洗脱液过0.22μm滤膜，得到样品
industries公司)；氮吹仪(北京普立泰仪器有限公司)；固相萃取装置(美国安捷伦公司)；milli-q纯化系统(美国millipore公司)；聚丙烯离心管：50ml，具塞；天平：感量为0.01g和0.1mg；shimadzu vp-ods c18色谱柱(2.0*150mm，5μm)；mcx固相萃取柱(60mg，3ml，美国waters公司)。
72.乙腈、甲醇(色谱纯，sunrise公司)；甲酸(色谱纯，德国fluka公司)；水为milli-q高纯水。
73.泰妙菌素和沃尼妙林标准品：纯度大于98％。
74.实施例1
75.配制标准工作液：
76.分别精密称取泰妙菌素和沃尼妙林各10mg(精确至0.01mg)，用乙腈溶解并定容至100ml，配制成质量浓度均为100mg/l的标准储备液；分别准确移取1ml上述储备液置于100ml容量瓶中，用乙腈定容配制成1.0mg/l的混合标准中间液；根据需要移取适量混合标准中间液，分别用乙腈稀释成质量浓度为1μg/l、2μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l的标准工作溶液。
77.样品预处理：
78.称取1.0g样品(精确至0.01g)于50ml具塞离心管中，加入20ml乙腈，盖上盖混匀，于涡旋振荡器上涡旋5min，萃取完毕后，以4000r/min离心5min。
79.mcx固相萃取柱(60mg，3ml)用3ml甲醇活化，3ml 0.1％甲酸水溶液平衡。取2ml上述乙腈提取液过柱，再依次以3ml 0.1％甲酸水溶液、3ml甲醇淋洗固相萃取柱，弃去流出液，洗耳球吹干，最后用3ml 5％氨水-甲醇(体积比为1:1)溶液洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹至近干，加入1ml乙腈涡旋溶解，溶液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
80.色谱分离梯度淋洗的条件如下表1：
81.表1 色谱分离梯度洗脱条件
[0082][0083]
质谱检测条件为：
[0084]
电喷雾电离源esi(+)，采用多反应监测(mrm)模式，参数参见下表2。
[0085]
表2 质谱检测参数
[0086][0087]
实验例1
[0088]
对被测物的混合溶液进行色谱分离及质谱检测：
[0089]
方法的线性关系、检出限和定量限
[0090]
在本方法所确定的实验条件下，分别配制浓度为1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、30.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml8个标准系列进行液质联用测定，以定量离子的响应峰面积(y轴)对相应的质量浓度(x轴，ng/ml)作图，其结果见表3。结果表明，泰妙菌素和沃尼妙林在1.0～100ng/ml范围内，定量离子的响应峰面积和样品浓度之间有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，见图3和图4。
[0091]
根据最终样液所代表的试样量，定容体积，进样量和进行测定时所受的干扰情况，以添加法确定液相色谱串联质谱法对泰妙菌素和沃尼妙林的检测低限为0.05mg/kg，定量限为0.1mg/kg，满足国内外的限量要求。
[0092]
表3 被测物的参考保留时间、监测离子对和裂解能量
[0093][0094][0095]
实验例2
[0096]
基质效应检测
[0097]
基质效应(matrix effects，me)是指色谱分离时共洗脱的物质对待测成分的离子化效应，所引起的信号的抑制或提高。基质效应影响大时会降低方法的灵敏度和影响方法的准确性，给测定带来误差，因此液相色谱-质谱方法开发和确证过程中需要对基质效应(matrix effects，me)做出评价。基质效应(matrixeffect,％)me＝(基质匹配标准曲线的斜率/纯溶剂标准曲线的斜率)
×
100％。一般认为，基质效应在85％～115％之间则认为基质效应不明显。本方法通过配制标准工作曲线和基质匹配校正曲线，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作图，以基质匹配校正曲线和标准曲线斜率的比值来考察化合物的基质效应。图2表明，对于所选粉剂、针剂和合剂3种类型样品，经过优化的前处理方法所得的样液经过稀释后再进样，且进样量为2μl，不存在明显的基质效应。因此本方法采用溶剂标准曲线进行准确定量，无需使用基质匹配的标准曲线。
[0098]
实验例3
[0099]
方法的回收率和精密度
[0100]
分别选取不含泰妙菌素和沃尼妙林的鱼腥草注射液、双黄连口服液和麻杏石甘颗粒为空白样品基质，在1、2、10倍测定低限的添加水平上进行添加回收率试验，每个水平重复做六次，测得方法的回收率范围为82.0％～106.5％，精密度范围为2.89％～8.95％，符合规定的要求，其检测结果见表4。
[0101]
表4 泰妙菌素和沃尼妙林的回收率和精密度
[0102]
[0103][0104]
本发明对多种兽药制剂进行了前处理，按照建立的色谱和质谱条件进行分析，样品均为未检出。由以上实施例可知，本发明提供了一种固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定兽药制剂中泰妙菌素和沃尼妙林含量的方法。本发明的检测方法检出两种化合物在1.0～100ng/ml范围内线性关系良好，相关系数大于0.999，方法的检出限为0.05mg/kg，定量限为0.1mg/kg。本发明的方法简单、快速、准确，可实现兽药制剂的快速测定。
[0105]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。