一种ARHGAP35蛋白在猪X和Y精子鉴定或分离中的应用的制作方法

al.identification of differentially expressed proteins between bull x and y spermatozoa[j].j proteomics.2012,77:59-67)、nuplc-ms/ms(de canio m,soggiu a,piras c,et al.differential protein profile in sexed bovine semen:shotgun proteomics investigation.[j].molecular biosystems.2014,10(6))等蛋白组学技术对牛x、y精子特异性蛋白进行鉴定。然而，在猪中目前未有成功验证的性别特异性精子膜蛋白报告。
[0005]
dia数据非依赖采集(data independent acquisition，dia)是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一，一度引领了定量蛋白质组学新发展。dia相比于传统label free的最大的优势在于高效测定复杂样品中相对低丰度的蛋白分子，极大地提高了定量分析的可信度，具有高通量、高分辨率、高可重现性、定量准确等优点，克服了精子膜蛋白低丰度的性质。如果能利用dia蛋白组学技术筛选出猪x、y精子特异性膜蛋白，开发出分选猪x、y精子的新方法，从而控制后代仔猪的性别，对于提高养猪业生产效率、经济效益和可持续发展具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种arhgap35蛋白在猪x和y精子鉴定或分离中的应用。
[0007]
本发明的另一目的在于提供一种arhgap35蛋白在猪育种中的应用。
[0008]
本发明的再一目的在于提供一种鉴定猪x和y精子的方法。
[0009]
本发明的第四个目的在于提供一种分离猪x和y精子的方法。
[0010]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011]
一种arhgap35蛋白在猪x和y精子鉴定或分离中的应用，所述的arhgap35蛋白为猪膜蛋白，用于鉴定或分离猪x和y精子；
[0012]
所述的应用中，所述的arhgap35蛋白作为分子标记、或通过抗原抗体反应或配体反应，鉴定或分离x和y精子；
[0013]
优选的，所述的应用中，所述的arhgap35蛋白作为分子标记、或作为蛋白免疫法的抗原或作为与配体作用的受体改变精子功能从而鉴定或分离x和y精子；
[0014]
所述的arhgap35蛋白的氨基酸序列如下所示：
[0015]
mmmarkqdvriptynisvvglsgtekekgqcgigksclcnrfvrpsadefhldhtsvlstsdfggrvvnndhflywgevsrsledcveckmhiveqtefiddqtfqphrstalqpyikraaatklasaeklmyfctdqlgleqdfeqkqmpdgkllidgfllgidvsrgmnrnfddqlkfvsnlynqlaktkkpivvvltkcdegveryirdahtfalskknlqvvetsarsnvnvdlafstlvqlidksrgktkiipyfealkqqsqqiatakdkyewlvsrivknhnenwlsvsrkmqaspeyqdyvylegtqkakklflqhihrlkhehierrrklylaalplafealipnldeidhlscikakklleakpeflkwfvvleetpwdatshidnmeneripfdlmdtvpaeqlyeahleklrnerkraemrrafkenletspfitpgkpweearsfimnedfyqwleesvymdiygkhqkqiidkakeefqellleyselfyeleldakpskekmgviqdvlgeeqrfkalqklqaerdalilkhihfvyhptketcpscpacvdakiehlissrfirpsdrnqknslsdpnidrinlvilgkdglarelaneiralctnddkyvidgkmyelslrpiegnvrlpvnsfqtptfqphgclclynskeslsyvvesieksrestlgrrdnhlahlpltlilvnkrgdtsgetlhsliqqgqqiasklqcvfldpasagigygrninekqisqvlkglldskrnlnlvsstasikdladvdlrivmclmcgdpfsaddilfpvlqsqtcksshcgsnnsvllelpiglhkkrielsvls
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[0016]
编码所述的arhgap35蛋白的基因的核苷酸序列如下所示：
[0017]
aggccgcgtgaggagggcatcggctgcttctggcgcgcgcaacggtgcgcgcgccccccgcggaccactcccttcgcctcagcgcgagtagacgctgcggctggcatcccttatcgcgcacgcgcagttgcccaccccgttccttctgcctcgcgctgcctcgcgccgcagccaccgcagtagcggcattttcttggggcgcacgcgcactgcgccctgtgcgcccgttccctggacccggccgctgcggtagcagtgagcccctcgggcgcgtacgggctttcacttctcccccacccagcgcgggttattccctcgcggcgcgcgctcaggggccgttatccccctgcagaggtccccgcaccacgcacgcgcagtagcgagggggcacgcgcgcgggagctggggccgcaggaaggaggtgccgctgccgccattgcgagggagggagggagcgagcaagcgaggctggtccgccctccccctggttcccgcccctccccccttcccctccccgccccccgccccgagggagagcagcggagcggcgggaggaggaggtggaggaggcggaggagggagcccgcgagggagggtccgcccggccccccgccgccggagctgccgccgccgccgccgccgccgccgcttcagccgccgctggacgaggagcaacagaacatggcgccggggccgccgtcgccgctcccgggaatccggaggccggggccgcgctgaggacgtccagctggaagaaatgttggctatttggcgatgagaagtagcgaaagctgacctcgtactggtgtacaaacactacgagaccttaacaccttggcttcgggctgccccacttataatgtcaggaagccattgggtccactggaaaacactaatctgatcttggaagtggctgatcgtggcaggatgtgtcgacaatgatgatggcaagaaagcaagatgtccgaattcccacctacaacatcagcgtggtgggattgtctgggacggagaaggagaagggccagtgcggcattggaaagtcctgtttatgcaaccgcttcgtgcgcccaagtgctgacgaatttcacttggaccatacctctgtccttagcaccagtgactttggtgggcgagtggtcaataatgaccactttctctattggggagaagttagccgttccctggaggattgtgtggaatgtaagatgcacattgtggagcagactgaattcattgatgatcagacttttcaacctcatcgaagtacggccctacagccctatatcaagagagctgctgcaaccaagctcgcatcagctgaaaaactcatgtacttttgcactgaccagctggggctggagcaggactttgagcagaaacaaatgccagatggaaagctgctaattgatggttttcttcttggtattgatgttagcaggggcatgaacaggaactttgatgaccagctcaagtttgtctctaatctctacaatcagcttgcaaaaacaaaaaagcccatagtggtggtcctgactaagtgtgatgagggtgttgagcggtacattagagatgcacatacttttgccttaagcaaaaagaacctccaggttgtggagacctcagcaagatccaatgtaaatgtggacttagctttcagcaccttagtgcaactcattgataaaagtcgggggaaaacaaaaatcattccttattttgaagctctcaagcagcagagtcagcagatagctacagcaaaagacaaatatgagtggctggtgagtcgcattgtgaaaaaccacaatgagaattggctgagcgtcagccgaaagatgcaggcctctcctgagtaccaggactatgtctatctggaagggactcagaaagccaagaagctttttctccagcacatccaccgcctcaagcatgagcatattgagcgcagaaggaagttgtacctggcagccctgccgttagcttttgaagctcttatacccaatctagatgaaatagaccacctaagttgcataaaagccaaaaagctcttggaggccaagccagaattcttgaagtggtttgttgtgcttgaagagacaccatgggatgccaccagccacattgacaacatggagaatgagcggattccctttgacttaatggacacagtccctgcagagcagttgtacgaggcccacttagagaagctgcggaatgagaggaaaaga
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cagcagtgccccttcttcttccacaaccggcccatcagcgagcctcccggcaccacgcccagctccccctctgccctggcttccactgtccccttcctcacctccacacctgttgcgagccagccctcaccaccccagtcgccaccacccaccccccagtccccgatgcagccactgctcccctcccagcttcaagctgaacacacgctgtgagcccccagggcccagggcaaaaggagacaaggtcttctctctttgacggggtggtatttggccttgaacaaaaccaggtctactagggcagaggtggagagggtgtcccctctctcttgtccccttctgaagacctcggcagtagcaccagccagcactccaccatcagctaggcggtctggtgccctgagcccagcactgcacacctggggctggctgcaggccctcccctttgatgtggacctttctgaggaccgaactggccaggcagcggtgcctgcggcccttcactgcgccccaggacccccccacccccgatctgtctgtgcataacagcctcaaggcgtccgcccactggacagagacctggccttggctggaggaggaggaggaggaggttctgagattcaggccgtcccagggcagggccagcaacccctaaagagaacacttgccgtccgttgcacctggctcttcccaccttccatagctgcacccccatgcccagttaaggggtgcagcctgtctagcagcctccttgggaacatgtgggccacagctctgccaccccaaggtaccatgctgaggacattagcccagcagaccagagcagagggagggtagctttgtgcctggaccgggtgagtgtgtgcagctccccctcgcaccccttcccgttcacaagccttggggatacgttcccttcaaaacaaaggaacactggaagaaaaatggaaagaccccctccaatgatttttaaaaagaaaaggaaagaaactataggaagaaaactacagacctcaagattcagctttcttcccacctctgccaagaggcagacaagtgaaaaaattggccctttgtgacagcaaaacaaggatgcccggggtgattgcctgagaccctgctggggccccacttaatgtcaggttactagagtctccttaccccaagaatactcagtttgagcccttgatgggaagagctggggagaccagcctggatcctggtctgcctgggcacccactgcagtgctgtggagacactcaggcgtgtgtccacggaggccagccgcgggtgctggggtgcacttgggatgtggtttagtgtggttgctgttgaagtggagtcatttgtatcgtgggctgtagggggtgctggcaggggtgtttgtgggaagtgggcagtatgagggaccgctcaagtgtgggggtccgcagcgccacgcagggctgtccttcgcgttcccgggccatcagggcccacaggaggtaaaggtacaaaggccatcagagtcgtgaggagggcatcatgcctgcctgtcaccaacctcctcccatggccttcccccgcccttcctggcttttccactggccttcctctgggagaggcctcctcgtgccccacctttggccctcaaacacagcaaccctgctaaggctgctgtagatactggctgcccctcgctccccgaggctgggccatggcctttgcagtggaaaagcctgacactaaggtaccctgggcatgggggtgtggggtagaggcccacatgccccctagtcctccagggctctttgcactttaagaagcagcacctgtggcatgttccaggctgccctgggtcgcctcagctgggtggcctgacaaaagaagagacgcctccaaacaatctcagccactcccagcctcaaactcttcttgttggctgctggagggtggcgtaggccctgtgctcactgacttcttcctctggataagctggatatcttagtgtttctggttcttgtacggcaaaataaggtgcttgggaaaattaaagcaacttttaccgcgtcttaaggacactacaagtcaaaaaacaaacctaaggtacatgaatgttttatgtaaatgttgtgatggactctcttctggtggggctgtgcttggtgctttaggtcagggcttggctggaaggtgatacttgtgtttagtttggacagagggggccaggcccaggcttctccagccctgcagctcccccagcgctgagccccaggcaggtcaggatacaactgcattgaattagtctctgcctttttctgggtcctgctcacctactcccagtcagtccttcaaagtatgggggggagggaagccacaggggtggtctggggccactgtcctttgtgctggcacactgggccatgctaccacctaaacttctgctctgtaccaggaacttcaccttcacaagcgcccccactcccctcagtccttgagactacatagacctgtaagcagtaggtgatttttctggaagggggcatacatagtaacggcaaacacagtgcttggcatccttccctgggtcagaatagcagagaccaggcctccagagggtagcctctagtcccacagcacccccctgctagccggtctgggcagctgcagaaaccccttacccctgcccctgttgtccctcaagggctctcacagtgtgcaggtggggacagggctcgtgcccagtgagccacagttggacaggtagctgtctgtttcctctgctaactctctaacttcttattttctgcttctcaggctgaccctggctggaagacgttttccggtcattctgagttggcattgcctgcagtagtagtaccgggccctgggcttccactccggtcattggggggtggggtcagcttttggaccaaaagggcccccagaggggacccatgaaggagtatgggcatggttggggcatgctgaccttaactagaatgttccccaccgctcccattc
atctgatgagctaagctctgaaaagctctttcacaagtcattttcatcggaactgcaccacactcaggattgagggcatggccgggggtcattagcattggccagggtggctaaacagttcaggggtgtcatggcacttgttccgtgccctacaccaaaacagttggatgcccagaagctctctccccatccagtgtgttctttttacccccagcagagtgtagacaccaaggactggaaggaaacaacccttgattttaagaatgagactgattctggatgtgacactgatgcttccacagagggagctggtccaaggttaggtagcgtggcttacgaatcttccttcagttcctggctgtgttgcatgtgggaaggccgtcacttgacattttggggagcaatgctgagtgctgtttcctgggttttcctacattgtactgccacgatcttcctgctttaggcaggaagcatgttgggggtgagtttgttctagcagagtgtgtttgtcttcaccagggtggccagagggtgacatcataggagcagcacactagcctcacctccttctggtcttgggggaggcctgaatggatgccttcccctatgtcgcaggtgttccagcctcagccctggaactcgcagaccagccagctgcaacctgtgtgatccaaggtcatctgcatccgcgagggaccccccccccagtgctccccagcatgctgctggggttgtctgcctaggggctctgctctgccagtggctgtttttccaagagaagcttcagggacttgggtgggtgctggggactgggttccctcacgccagcatcctcctgtgctgtgggcatggtgtgctctggggcctggagacagtcccagcgctcacccccaagcaccggtgactctccatagatgatggacaggagttgctgccactcttgcttggcaggttcaagctgatcactcatgcttaggtgaaagaacgactgagtcttgtgtgctggaaacctgagtcacatctgtggctgccagtgattgcaccaggaaaggcatggcgtgaggggaagggcctccccagctgtgcctgttgtgctgtcctggaagagaaggattcttacctcctctgggagccatcattcaactcctcaaggattggaagtgactccccgcagcaccctgccccactgcccagcagccctccctcagcagcaggctccatcagcagtgatgtcacacttcagtgtagtcaagacagggcctaagttattgtttgcataaaaaagaatcatgttccctgtgtacatttaaaaaaaaaaaaagtgaattgtaagagaataaaacttgtttgaaaatttggaata
[0018]
所述的arhgap35蛋白在猪育种中的应用；
[0019]
一种鉴定猪x和y精子的方法，包含如下步骤：
[0020]
以arhgap35蛋白为分子标记，采用蛋白质印迹法或免疫荧光鉴定猪x和y精子，其中，arhgap35蛋白在x精子细胞的表面特异性地表达；
[0021]
一种分离猪x和y精子的方法，包含如下步骤：
[0022]
以arhgap35蛋白为抗原或受体，采用采用抗体抗原反应或配体反应特异性改变猪x或y精子的功能，从而分离x或y精子，其中，arhgap35蛋白在x精子细胞的表面特异性的表达；
[0023]
本发明的原理：
[0024]
首先，本发明对猪x、y性别控制精子进行膜蛋白提取，之后取出一部分做蛋白浓度测定，另取部分进行胰蛋白酶酶解和除盐；
[0025]
第二，对酶解肽段样品和除盐后的酶解肽段样品进行lc-ms/ms鉴定，lc-ms/ms鉴定分为两个主要步骤：第一步采用传统的dda方法建立蛋白谱图库，第二步采用dia技术采集每个样品的质谱数据，在dda数据库的基础上进行谱图匹配、定量信息的提取以及后续统计分析等。
[0026]
随后，利用数据库检索得到的定量数据，保留任意一组样品有表达值占比≥50％的蛋白；缺失值≤50％的蛋白用同组样本均值填充，经median normalization及log2对数转换，得到可信蛋白。
[0027]
在可信蛋白基础上，选取两个标准计算样品间的差异。使用foldchange评估某一蛋白在样品间的表达水平变化倍数；经t-test检验计算的p-value展现样品间差异的显著程度，根据foldchange＞1.2倍且p-value《0.05的阈值进行差异表达蛋白筛选，筛选出x、y
精子特异表达的膜蛋白arhgap35蛋白。
[0028]
最后，随机挑选六份已经分选的x精子和y精子，分别使用western blotting和dna荧光定量pcr法对其性别进行鉴定，确定并验证arhgap35蛋白为x精子中特异性表达的细胞膜蛋白，可以作为鉴定及分离猪x、y精子性别的特异性标识蛋白。
[0029]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0030]
(1)本发明利用dia蛋白组学技术对猪x、y精子膜蛋白进行蛋白质组学分析，然后鉴定筛选到在x精子膜蛋白中特异性表达的蛋白arhgap35，可以作为分离猪x、y精子的性别特异性标识蛋白。
[0031]
(2)本发明首次鉴定到在猪x精子中特异性表达的蛋白arhgap35，该蛋白既可以作为分子标记，也可以作为蛋白免疫法的抗原或作为配体作用的受体改变精子功能从而分离x、y精子，有望实现一种低成本、损伤小、高效、简便的精子性别分选方法，有助于畜牧业的可持续发展，有助于缓解未来粮食紧缺问题也有助于解决一系列动物福利问题，具有重要的应用价值。
附图说明
[0032]
图1是膜蛋白arhgap35在x精子和y精子中表达量的结果分析图。
[0033]
图2是精子dna荧光定量pcr法检测猪精子性别的结果分析图。
[0034]
图3是western blotting检测猪精子中膜蛋白arhgap35表达的结果分析图。
[0035]
图4是膜蛋白arhgap35在猪精子中表达量的结果分析图。
具体实施方式
[0036]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0037]
下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得；实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0038]
试验仪器：agilent 1100hplc高ph分离液相色谱仪(agilent)、easy-nlc 1200高效纳升液相色谱仪(thermofisher)、q exactive hf质谱仪(thermofisher)、荧光定量pcr仪(abi)、powerpac通用电泳仪(bio-rad)、pcr仪(thermofisher)、流式细胞仪和凝胶成像系统(uvp)等。
[0039]
试验材料：mem-per
tm
plus膜蛋白提取试剂盒(thermo fisher)、蛋白酶抑制剂(thermo fisher)、bca试剂盒(thermoscientific)、sds裂解液(碧云天)、irt标准品(biognosys,thermo fisher)、powerup
tm
sybr
tm
green master mix(thermo fisher)、6
×
protein loading buffer(全式金)、tbs缓冲液(赛维尔)、tween20(sigma)、脱脂奶粉(生工)、arhgap35抗体(novus)、gapdh抗体(爱必信)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg(h+l)(碧云天)和cecl western blot kit低背景化学发光检测试剂盒(cwbio)等。
[0040]
实施例1 精子膜蛋白的提取
[0041]
1.1猪的精液样本采集与分离工作在内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院进行：样本采集使用手握法，采集三只正常生育的大白种公猪(由温氏食品集团股份有限
公司提供)的精液，将采集到的公猪精液按照常规方法进行流式细胞仪分选，得到性别控制x精液和性别控制y精液；
[0042]
1.2用mem-per
tm
plus膜蛋白提取试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司)分别提取上述性别控制x精液和性别控制y精液的膜蛋白，具体步骤如下：
[0043]
(1)将含1亿个精子的精液在2000
×
g条件下离心5min，然后用3ml mem-per
tm
plus细胞清洗液洗细胞沉淀并在2000
×
g下离心5min；
[0044]
(2)小心移除并丢弃上清液，然后将细胞重悬于1.5ml的mem-per
tm
plus细胞清洗液，之后转移到一个2ml的离心管中，2000
×
g离心5min并丢弃上清液；
[0045]
(3)向细胞沉淀中加入0.75ml mem-per
tm
plus透化缓冲液(提前与蛋白酶抑制剂按照体积比100:1混匀)，短暂涡旋获得均质的细胞悬液，在持续混匀条件下4℃孵育10min；
[0046]
(4)将透化后的细胞以16000
×
g的速度离心15min，小心地去掉含有胞质蛋白的上清液；
[0047]
(5)向沉淀中加入0.25ml mem-per
tm
plus增溶缓冲液(提前与蛋白酶抑制剂按照体积比100:1混匀)并用吸管上下抽吸进行重悬，在持续混匀条件下4℃孵育60min；
[0048]
(6)在4℃条件下，将反应管以16000
×
g的速度离心15min；将含有可溶性膜蛋白和膜相关蛋白的上清液转移到一个新的反应管中，分别得到x精子样品膜蛋白溶液和y精子样品膜蛋白溶液。
[0049]
实施例2 蛋白质组学分析
[0050]
1.1蛋白浓度测定
[0051]
取实施例1制得的精子膜蛋白溶液(x精子样品膜蛋白溶液或y精子样品膜蛋白溶液)，采用bca(bicinchonininc acid)法测定浓度。具体步骤如下：
[0052]
(1)按照bca试剂盒说明书，根据buffer a：buffer b＝50:1(v/v)配置所需体积的显色液；
[0053]
(2)取出部分待测蛋白溶液，加mem-per
tm
plus增溶缓冲液进行稀释(防止浓度过高，超出标准曲线工作范围)；
[0054]
(3)准备一个干净的96孔板，加入如下梯度的bsa标准蛋白溶液：0、1、2、4、8、12、16、20μl，然后每个孔加入相应体积的超纯水补充体积至20μl；
[0055]
(4)将2μl待测蛋白溶液加入96孔板，每个样品设置三个复孔，同样补充体积至20μl；
[0056]
(5)各孔内加入200μl预配置的显色液(显色液必须现用现配)，37℃反应30min；
[0057]
(6)使用酶标仪进行吸光度值测定(波长562nm)；
[0058]
(7)根据标准蛋白溶液的已知浓度和吸光度值计算标准曲线，代入待测样品的吸光度值，即可算得蛋白浓度值(见表1)。
[0059]
表1 精子膜蛋白浓度
[0060]
[0061][0062]
1.2胰蛋白酶酶解
[0063]
(1)根据步骤1.1测定的蛋白浓度，每个样品取50μg的蛋白，并用sds裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积；
[0064]
(2)在以上蛋白溶液中加入二硫苏糖醇(dtt)，使得dtt的终浓度为4.5mm，混匀，在55℃孵育30min；
[0065]
(3)在冰上进行冷却直到达到室温后加入相应体积的碘乙酰胺，使得碘乙酰胺终浓度为9mm，充分混匀，室温避光放置15min；
[0066]
(4)在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白，-20℃放置4h以上或者过夜；
[0067]
(5)4℃、8000
×
g离心10min收集沉淀，挥发丙酮2-3min；
[0068]
(6)加入100μl四乙基溴化铵(teab2)复溶沉淀，随后加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶trypsin-tpck，并于37℃消化过夜；
[0069]
(7)加磷酸调ph值为3左右终止酶解反应。
[0070]
1.3肽段除盐
[0071]
将步骤1.2酶解后的肽段采用sola
tm
spe 96孔板脱盐，具体步骤如下：
[0072]
(1)活化：200μl甲醇活化柱子，重复3次；
[0073]
(2)平衡：200μl纯水活化柱子，重复3次；
[0074]
(3)将步骤1.2酶解后的肽段样品溶液ph调节至7后上样，随后调节真空过柱，液滴速度保持在1ml/min，并重复一次；
[0075]
(4)200μl 5％(v/v)甲醇清洗，重复3次；
[0076]
(5)洗脱：150μl 60％(v/v)甲醇洗脱肽段，重复3次，得到450μl洗脱液，真空挥干。
[0077]
1.4 lc-ms/ms高分辨质谱检测(上海鹿明生物公司)
[0078]
质谱进样前，每个样品按照体积比irt标准品：待测样品＝1:10的体积比混合，作为内标。
[0079]
(1)高ph液相分离
[0080]
样品：将部分步骤1.3除盐后的肽段样本取等量肽段混合，使用agilent 1100 hplc系统，在ph＝10的流动相中进行组分分离。
[0081]
分离条件：
[0082]
色谱柱：agilent zorbax extend
–
c18窄径柱，2.1
×
150mm，5μm。
[0083]
检测波长：紫外210nm和280nm。
[0084]
流动相a相：乙腈(acn)-h2o(2：98，v/v)，流动相b相：acn-h2o(90：10，v/v)(两个流动相均用氨水调节ph至10)，流速：250μl/min。
[0085]
梯度洗脱条件：0-10min，2％b；10-10.01min，2-5％b；10.01-37min，5-20％b；37-48min，20-40％b；48-48.01min，40-90％b；48.01-58min，90％b；58-58.01min，90-2％b；
58.01-63min，2％b。
[0086]
组份收集：第10分钟开始，依次每隔一分钟收集洗脱液到1-10号离心管中，按照1
→
10的顺序循环收取馏分。共收集10个组份，真空冷冻干燥抽干，样品冷冻保存待上质谱。
[0087]
(2)液质联用条件
[0088]
使用easy-nlc 1200高效纳升液相色谱仪和q exactive hf质谱仪对步骤(1)收集到的10个组分进行dda质谱扫描，扫描参数见表2：
[0089]
表2 数据依赖采集(data-dependent acquisition，dda)质谱条件
[0090]
itemsfull msms2resolution12000030000agc target3e61e5maximum injection time100ms50msscan range350-1650m/z200-2000m/zisolation window-1.4m/znormalized collision energy-27
[0091]
液相洗脱梯度见表3：
[0092]
流速300nl/min，buffer a为0.1％fa(三氟乙酸)水溶液，buffer b为0.1％fa/80％acn/20％水(该段百分比为体积百分比)。
[0093]
表3 数据依赖采集(data-dependent acquisition，dda)色谱条件
[0094][0095][0096]
取剩余步骤1.3除盐后的肽段单独上机(easy-nlc 1200高效纳升液相色谱仪和qexactive hf质谱仪)，进行dia质谱扫描，扫描范围设置为350-1250m/z，isolation window为26m/z，质谱扫描参数见表4：
[0097]
表4 数据非依赖采集(data independent acquisition，dia)质谱条件
[0098]
itemsfull msms2resolution12000030000agc target3e61e6maximum injection time100msauto
scan range350-1250m/z-isolation window-26m/znormalized collision energy-28
[0099]
dia液相洗脱梯度见表5：
[0100]
表5 数据非依赖采集(data independent acquisition，dia)色谱条件
[0101]
time(min)gradient02％b8244％b8490％b9090％b
[0102]
流速300nl/min，buffer a为0.1％fa水溶液，buffer b为0.1％fa/80％acn/20％水。
[0103]
1.5数据处理以及分析
[0104]
此操作的目的是将质谱输出的谱图与fasta库产生的理论谱图进行匹配，将机器信号转变为肽段和蛋白序列信息，然后结合序列信息、肽段保留时间、碎片离子信息等进行谱图库的建立，便于后续的dia分析。将lc-ms/ms质谱原始文件导入spectronaut pulsar软件进行dda建库，主要参数见下表。
[0105]
表6 数据依赖采集(data-dependent acquisition，dda)建库参数
[0106][0107][0108]
dia原始数据的处理使用spectronaut pulsar软件完成，关键步骤如下：
[0109]
(1)打开spectronaut pulsar软件的analysis模块，选择“+”新建分析；
[0110]
(2)根据软件提示逐步完成参数设置，开始分析；
[0111]
(3)分析完成，进入“report”模块导出定量数据。
[0112]
表7 数据非依赖采集(data independent acquisition，dia)数据解析关键参数
[0113]
itemspara.precursor qvalue cutoff0.01protein qvalue cutoff0.01
normalization strategylocal normalizationquantity ms-levelms2
[0114]
随后利用数据库检索得到的定量数据，保留任意一组样品有表达值占比≥50％的蛋白。缺失值≤50％的蛋白用同组样本均值填充，经median normalization及log2对数转换，得到可信蛋白。随后，对鉴定到的蛋白进行差异表达分析，差异筛选条件为foldchange＝1.2倍且p-value《0.05。最后arhgap35被鉴定为x精子特异性膜蛋白标识。分子标记arhgap35在x精子中表达量高于y精子(x：160199vs y:3247)(见图1所示)。
[0115]
实施例3 dna荧光定量pcr法鉴定精子性别
[0116]
3.1精子dna提取
[0117]
(1)根据实施例1重新采集三只正常生育的大白种公猪的精液，使用流式细胞仪进行分选，得到性别控制x精液和性别控制y精液，得到共计6个精液样品；
[0118]
(2)将含1000-2500个精子的精液在2000
×
g条件下离心5min，弃上清，用5μl裂解液(200mm koh，50mm dtt)重悬，并在pcr仪中65℃孵育20min。
[0119]
(3)加入5μl中和液(900mm tris-hcl，ph＝8.3)终止反应，并用ddh2o稀释至40μl。
[0120]
3.2 pcr引物
[0121]
应用oligo7软件，根据引物设计的基本原则，设计sry(y染色体特异性基因)与amelx(x染色体特异性基因)基因pcr扩增引物(表1)，交由华大基因合成。
[0122]
表8 荧光定量pcr检测用引物
[0123][0124][0125]
3.3荧光定量pcr反应
[0126]
pcr反应体系如下表：
[0127]
表9 荧光定量pcr反应体系
[0128]
组分用量(μl)精子dna模板2引物f0.2引物r0.2powerup
tm
sybr
tm
green master mix5.0ddh2o2.6总体积10.0
[0129]
pcr反应程序如下表：
[0130]
表10 pcr反应程序
[0131][0132]
使用2
‑△△
ct
法计算sry和amelx基因在不同精子样本中的相对表达量，各样品中x精子和y精子的比例如图2所示，检测结果与流式细胞仪分选结果一一对应。
[0133]
实施例4 arhgap35蛋白定量法鉴定精子性别
[0134]
4.1参照实施例1方法提取实施例3中6个精液样本的膜蛋白，参照实施例2方法测定其膜蛋白浓度；然后各样品分别取30μg蛋白，加入6
×
protein loading buffer和mem-per
tm
plus增溶缓冲液稀释至同样浓度和体积，99℃孵育10min变性蛋白，蛋白变性体系如下表所示：
[0135]
表11 蛋白变性反应体系
[0136][0137]
4.2配置tbst缓冲液：tbt缓冲液干粉彻底溶解于2l双蒸水中，再加入2ml tween20，搅拌25min；
[0138]
4.3采用10％(质量百分比)sds-page凝胶电泳分离膜蛋白，然后转移至硝酸纤维素膜上；转膜结束后用tbst缓冲液将膜洗涤3次，每次5min，随后用含5％(质量百分比)脱脂奶粉的tbst缓冲液在室温条件下封闭2h；
[0139]
4.4用tbst缓冲液将膜洗涤3次，每次5min，分别加入arhgap35抗体和gapdh抗体，4℃过夜；
[0140]
4.5用tbst缓冲液洗涤3次，每次5min，然后用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg(h+l)在室温条件下孵育2h；
[0141]
4.6用tbst缓冲液洗涤3次，每次5min，随后使用cecl western blot kit低背景化学发光检测试剂盒进行了印迹曝光。
[0142]
4.7使用image j软件(http://imagej.net/imagej)统计灰度值。
[0143]
检测结果见图3和图4。结果表明，arhgap35蛋白定量法鉴定结果与dna荧光定量pcr法相同。精子1中arhgao35蛋白表达量较高，鉴定为x精子，与dna荧光定量pcr法结果相同；精子2中arhgao35蛋白表达量较高，鉴定为x精子，与dna荧光定量pcr法结果相同；精子3中arhgao35蛋白表达量较高，鉴定为x精子，与dna荧光定量pcr法结果相同；精子4中arhgao35蛋白表达量较低，鉴定为y精子，与dna荧光定量pcr法结果相同；精子5中arhgao35蛋白表达量较低，鉴定为y精子，与dna荧光定量pcr法结果相同；精子6中arhgao35蛋白表达量较低，鉴定为y精子，与dna荧光定量pcr法结果相同。
[0144]
上述结果表明，arhgap35蛋白可以作为鉴定和分离x、y精子的细胞表面标识蛋白。
[0145]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。