一种应用凝胶高效富集微量细胞制备细胞蜡块的方法与流程

1.本发明涉及生物细胞样品的制备方法，尤其是一种应用凝胶高效富集微量细胞制备病理(肿瘤细胞)蜡块的方法。


背景技术：

2.细胞蜡块制作技术已在临床病理工作中得到应用，蜡块制作技术成熟，可以借用现有技术和设备快速提供细胞蜡块，供病理科医生在显微镜下观察，在许多方面，优于薄层液基细胞观察，如蜡块切片能观察到甲状腺肿瘤细胞形成的乳头状结构，对于病理科医生的定性诊断非常重要。细胞蜡块也可以用于后续的免疫组织化学分析和分子病理检测，并且可以对分子检测进行细胞水平的质控：判断是否有肿瘤细胞和肿瘤细胞含量分析。因此，细胞蜡块的出现大大弥补了细胞涂片对肿瘤诊断的不足。目前，虽然胸腹水等病理样本可以通过直接离心得到大量细胞沉淀而制作成细胞蜡块，但还有部分样本细胞量少(在临床中这种情况极多，如细针穿刺甲状腺、乳腺穿刺和妇科宫颈刷检样本、内窥镜检查时的冲洗液等)，仅常规离心管离心后，几乎得不到细胞沉淀物，无法制成细胞蜡块，给诊断造成困难。
3.又如，胸腔积液细胞学检查具有简单、易行、可重复等优点,然而传统的细胞学涂片技术普遍存在细胞堆积重叠,背景染色深而不易观察、样本无法长期保存等缺点,而细胞蜡块不仅能解决上述问题,更能在后期进行免疫组化及分子检测等,弥补常规涂片的不足。细胞蜡块有明显的临床病理诊断价值,而恶性胸腔积液的细胞蜡块价值更大。但用常规的方法只有少量的细胞时制备细胞蜡块成功率不高。参见探讨细胞蜡块成功率与胸腔积液性质的相关性(梁龄伊等，诊断病理学27卷3期)一文。
4.cn2006800280275提出了从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中回收dna、rna或蛋白质片段的系统，涉及一种直接收集琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上的dna、rna或蛋白质的装置,所述dna、rna或蛋白质是在对其使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳后经分离和纯化得到的。


技术实现要素：

5.本发明目的是，提出一种应用凝胶高效富集微量细胞制备病理(细胞)蜡块的方法。对于临床中大量样本细胞量少的场合，用常规离心管离心，应用凝胶高效富集制成细胞蜡块。并能获得良好的效果。
6.本发明的技术方案是，一种应用凝胶高效富集微量细胞制备病理(细胞)蜡块的方法，琼脂粉溶于pbs缓冲液使其终浓度为1.5-3％，加热至沸腾，冷却至50
±
5℃的琼脂液体备用。
7.将含细胞的样本用中性福尔马林固定液放入离心管中离心，弃上清液；用滴管吸少量融化的琼脂液体，加入离心管底部，使得琼脂液体与沉淀结合；室温放置至琼脂完全凝固；凝固琼脂体内包裹了沉淀细胞的样本；凝固琼脂体经固定、脱水，取出凝固琼脂体进行
石蜡包埋：加入溶解石蜡，浸蜡后，冷却凝固后再进行切片。
8.有益效果：本发明能高效富集来源于人体的少量细胞，制备成细胞蜡块，解决了临床部分样本细胞含量少，无法进行病理诊断及其他检查的瓶颈。
9.细胞蜡块及切片的诊断质量高，可以用于后续的病理诊断、免疫组织化学辅助诊断、分子靶向治疗伴随诊断等。所富集的细胞保持有立体组织结构，有利于病理诊断，在这方面优于传统细胞涂片和液基细胞学制备的片子，涂片和液基制备的细胞片子只有细胞的平面结构，缺乏立体结构。与其他细胞蜡块制备方法比较，简便、成本低、不需要特殊材料和仪器。此细胞蜡块的制作方法完全兼用于现有的设备与方法。
附图说明
10.图1为三个甲状腺肿瘤穿刺细胞样本，经中性福尔马林固定液后放入离心管中离心，弃上清液，加入一定量琼脂，琼脂凝固后的三个离心管照片。
11.图2为图1中一个生物样本被凝固的琼脂块包裹，从离心管中取出并移至滤纸上图片。
12.图3为经过固定、脱水、透明和浸蜡一系列程序后的凝固的琼脂块。
13.图4为三个生物样本石蜡包埋块；
14.图5为图4对应的三个生物样本切片。
15.图6为图5中一个生物样本切片进行常规h&e染色后，其中一个甲状腺癌细胞样本显微镜观察照片，可以清楚观察到癌细胞形成的乳头状结构和每个癌细胞核和浆的染色(彩色照片的效果更佳)。
具体实施方式
16.如图所示，应用凝胶高效富集微量细胞制备病理(细胞)蜡块的方法，琼脂粉溶于pbs缓冲液使其终浓度为1.5-3％均可，微波或电炉或热焰方式加热至沸腾(过程中搅拌更好)，冷却至50℃的琼脂液体备用；如称2克琼脂粉溶于100ml pbs缓冲液使其终浓度为2％，微波炉加热至沸腾，冷却至50℃左右备用。
17.将含细胞的样本用中性福尔马林固定液放入离心管中离心，弃上清液；用滴管吸少量融化的琼脂液体，尤其是加入离心管底部，使得琼脂液体与沉淀结合(图2所示)；室温放置至琼脂完全凝固；凝固琼脂体内包裹了沉淀细胞的样本；凝固琼脂体经固定、脱水，取出凝固琼脂体(图3所示)进行石蜡包埋：加入溶解石蜡，浸蜡后，冷却凝固后再进行切片(图4为三个生物样本石蜡包埋和三个切片图)。染色后在显微镜下得到图5为三个生物样本切片的照片。
18.含细胞的样本的制备可以应用多种样本：将细针穿刺肿块的针头及针管内组织立即用4％甲醛反复抽吸冲洗，得到含细胞的样本及中性福尔马林固定液放入离心管；再放入离心机内以900-1500r/min离心5分钟，吸管吸弃固定液，图1为三个甲状腺肿瘤穿刺细胞样本，经上处理后经琼脂凝固后的三个离心管照片。
19.或者用含肿瘤细胞的其他体液(尿、胸水、腹水、支气管灌洗液、心包积液和脑脊液等)离心沉淀也可以制备成含细胞的样本。在管底剩留的沉淀细胞中，用滴管吸少量融化的琼脂液体加入离心管底部；使得琼脂液体与沉淀包裹结合；室温冷却或放入冰箱内冷却凝
固后，加入少量清水，用塑料吸管轻轻吹起凝固的琼脂块，移至滤纸上，放入包埋塑料盒中。放入自动脱水机中，经过固定、脱水、透明和浸蜡一系列程序后，取出琼脂块。进行石蜡包埋：加入溶解石蜡，浸蜡后，冷却凝固后再进行切片、染色，细胞石蜡块样本可以进行其他检查。


技术特征：
1.一种应用凝胶高效富集微量细胞制备细胞蜡块的方法，其特征是，采用琼脂粉溶于pbs缓冲液使其终浓度为1.5-3％，加热至沸腾，冷却至50
±
5℃的琼脂液体备用；将含细胞的样本用中性福尔马林固定液放入离心管中离心，弃上清液；琼脂液体加入离心管，使得琼脂液体与沉淀结合；室温放置或冷藏至琼脂完全凝固；凝固琼脂体内包裹了沉淀细胞的样本；凝固琼脂体经固定、脱水，取出凝固琼脂体进行石蜡包埋：加入溶解石蜡，浸蜡后，冷却凝固后再进行切片。2.根据权利要求1所述的应用凝胶高效富集微量细胞制备细胞蜡块的方法，其特征是，用滴管吸少量融化的琼脂液体，加入离心管底部，使得琼脂液体与沉淀结合。

技术总结
一种应用凝胶高效富集微量细胞制备细胞蜡块的方法，琼脂粉溶于PBS缓冲液使其终浓度为1.5-3％，加热至沸腾，冷却至50


技术研发人员：王建东 何燕 鲍炜
受保护的技术使用者：中国人民解放军东部战区总医院
技术研发日：2022.05.27
技术公布日：2022/10/10