一种基于衍生化手段检测神经递质的方法

1.本发明属于生物分析化学技术领域，尤其涉及一种基于衍生化手段检测神经递质的方法。


背景技术：

2.神经递质是神经系统中起信使作用的一类小分子代谢物，包括血清素(5ht)、多巴胺(da)、γ-氨基丁酸(gaba)、肾上腺素和牛磺酸等多种生物胺类和氨基酸类物质。研究人员发现，神经递质通过沟通神经元细胞而在宏观上调控一系列生物学过程，包括运动、记忆、学习等，其代谢水平也与神经系统疾病相关，包括阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、精神分裂等。因此，测量神经递质小分子在组织中的丰度及空间分布，有助于理解神经过程和疾病的病理机制。
3.除此以外，有研究表明各类神经递质有治疗和预防疾病的潜质，因此被广泛应用于食物、功能性饮品、保健品中，因此发展一种测定神经递质小分子的手段可以成为对化学样品的质检手段。
4.基质辅助激光解吸电离质谱(maldi-ms)是一种操作简单、灵敏度高的质谱技术，可以在实现对多类别物质的原位检测，已被广泛应用于生物和临床分析的各个领域。然而利用maldi-ms分析神经递质的技术仍然存在诸多困难。首先，脑内多种小分子神经递质浓度含量低至μg/g水平，且生物胺类神经递质在常温、中性至碱性条件下易发生氧化降解，难以检测及准确定量。其次，神经递质小分子在maldi质谱中的质荷比通常小于200，与maldi技术传统使用的基质试剂在同一个区域出峰，难以有效区分二者。
5.针对神经递质丰度低、易降解的问题，在液相色谱-质谱联用平台上，常采用柱前衍生化的方法，例如采用丹磺酰氯或氯甲酸-9-芴甲酯(fmoc-cl)等酰氯型试剂，以及邻苯二甲醛(opa)、苯异硫氰酸酯(pitc)、2,4-二硝基氟苯(dnfb)等衍生化试剂。在maldi ms平台上，待测物和基质出峰重叠的问题，也可以通过衍生化方法增大分子量来解决。因此，发展一种能够选择性衍生神经递质的试剂及相应的反应条件，是一项有利于神经递质在maldi-ms平台上被检出的重大技术改进。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于衍生化手段检测神经递质的方法，该方法具有较低的检出限及较好的重复性。
7.本发明提供了一种基于衍生化手段检测神经递质的方法，包括以下方法：
8.s1)将衍生化试剂溶液与待测溶液混合，得到待测样品；所述衍生化试剂溶液包括式(i)所示的吡啶鎓离子；所述待测溶液包括神经递质和/或其代谢产物；所述神经递质包含氨基和/或羟基；
[0009][0010]
其中，x为卤素，r为c1～c5的烷基；
[0011]
s2)将所述待测样品与maldi用基质混合后进行质谱分析。
[0012]
优选的，所述衍生化试剂溶液中衍生化试剂的浓度为1～15mg/ml。
[0013]
优选的，所述x为氟，r为c1～c3的烷基。
[0014]
优选的，所述衍生化试剂溶液包括式(ii)所示的吡啶鎓离子：
[0015][0016]
优选的，所述衍生化试剂溶液的溶剂为第一乙腈水溶液；所述第一乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为1：(0.5～2)；
[0017]
所述待测溶液的溶剂为水或第二乙腈水溶液；所述第二乙腈水溶液中乙腈与水的体积比小于等于1：2。
[0018]
优选的，所述待测溶液中神经递质和/或其代谢产物的浓度为0.01～10μg/ml；所述衍生化试剂溶液与待测溶液的体积比为1：(0.5～2)。
[0019]
优选的，所述步骤s1)中混合的方法为涡旋；混合的时间为10～60s。
[0020]
优选的，所述maldi用基质选自α-氰基-4-羟基肉桂酸；所述maldi用基质以maldi用基质溶液的形式与待测样品混合；所述maldi用基质溶液中maldi用基质的浓度为5～10mg/ml；所述待测样品与maldi用基质溶液的体积比为1：(0.5～2)。
[0021]
优选的，所述质谱分析为maldi-tof/ms；所述质谱分析得到的质谱数据基于非靶向分析获得。
[0022]
优选的，所述质谱分析的条件为：质谱全扫描范围为m/z 100～1200da，激光强度为60～90％，正离子反射模式；激光激发源是355nm和2khz，固态355nm nd：yag激光器。
[0023]
本发明提供了一种基于衍生化手段检测神经递质的方法，包括以下方法：s1)将衍生化试剂溶液与神经递质溶液混合，得到待测样品；所述衍生化试剂溶液包括式(i)所示的吡啶鎓离子；所述神经递质包含氨基和/或羟基；s2)将所述待测样品与maldi用基质混合后进行质谱分析。与现有技术相比，本发明利用式(i)所示的吡啶鎓离子作为目标分析物的衍生化试剂，吡啶鎓离子可与醇羟基、酚羟基、伯胺和仲胺发生反应，从而实现对多类别神经递质小分子的衍生化，衍生化反应在常温常压下进行，反应效率高，机理明确，产物稳定，且衍生化产物中引入了正离子，可帮助衍生化产物在质谱分析时的激发，同时利用传统的maldi用基质辅助出峰，从而提高了分析物的解析/电解效率并改善了maldi分析的检出限
和重复性；并且衍生化试剂与maldi试剂均为容易获取的化学试剂，可以更低成本、更清晰便捷地获得神经递质在生物样品中的成分信息。
[0024]
附图说明
[0025]
图1为本发明血清素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)发生衍生化反应的机理图；
[0026]
图2为本发明实施例2中脑组织中血清素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图；
[0027]
图3为本发明实施例2中脑组织中血清素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图；
[0028]
图4为本发明实施例2中脑组织中γ-氨基丁酸(gaba)与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图；
[0029]
图5为本发明实施例2中脑组织中去甲肾上腺素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图。
具体实施方式
[0030]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031]
本发明提供了一种基于衍生化手段检测神经递质的方法，包括以下方法：
[0032]
s1)将衍生化试剂溶液与待测溶液混合，得到待测样品；所述衍生化试剂溶液包括式(i)所示的吡啶鎓离子；所述待测溶液包括神经递质和/或其代谢产物；所述神经递质包含氨基和/或羟基；
[0033][0034]
其中，x为卤素，优选为氟或氯，更优选为氟；r为c1～c5的烷基，优选为c1～c4的烷基，更优选为c1～c3的烷基，再优选为c1～c2的烷基；
[0035]
s2)将所述待测样品与maldi用基质混合后进行质谱分析。
[0036]
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售或自制均可；如所述神经递质可为市售的化学品，也可为提取得到的神经递质；如可从脑组织中提取血清素，将脑组织与溶剂混合低温研磨后涡旋振荡，然后离心取上清液；当分析的是其他生物样品，需要视情况调整，如血清等体液样品提取应改为有机溶剂沉淀蛋白提取。
[0037]
将衍生化试剂溶液与待测溶液混合，得到待测样品；所述衍生化试剂溶液包括式(i)所示的吡啶鎓离子，优选包括式(ii)所示的吡啶鎓离子；所述衍生化试剂溶液中的阴离子优选为有机类阴离子，更优选为对甲苯磺酸离子；所述衍生化试剂溶液的溶剂优选为第一乙腈水溶液；所述第一乙腈水溶液中乙腈与水的体积比优选为1：(0.5～2)，更优选为1：
(0.5～1.5)，再优选为1：(0.8～1.2)，最优选为1：1；所述衍生化试剂溶液中衍生化试剂的浓度优选为1～15mg/ml；所述待测溶液包括神经递质和/或其代谢产物；所述待测溶液中的神经递质为本领域技术人员熟知的包含氨基和/或羟基的神经递质即可，并无特殊的限制，可为氨基酸类神经递质也可为生物胺类神经递质，优选为血清素(5ht)、多巴胺(da)、γ-氨基丁酸(gaba)、肾上腺素与牛磺酸中的一种或多种；所述神经递质溶液中的溶剂优选为水或第二乙腈水溶液，所述第二乙腈水溶液中乙腈与水的体积比优选为小于1:2；所述待测溶液中神经递质的浓度优选为0.01～10μg/ml；所述衍生化试剂溶液与待测溶液的体积比优选为1：(0.5～2)，更优选为1：(0.5～1.5)，再优选为1：(0.8～1.2)，最优选为1：1；所述混合的方法优选为涡旋；所述混合的时间优选为10～60s，更优选为20～50s，再优选为30～40s。
[0038][0039]
将所述待测样品与maldi用基质混合后进行质谱分析；所述maldi用基质为本领域技术人员熟知的基质即可，并无特殊的限制，本发明中优选为α-氰基-4-羟基肉桂酸；所述maldi用基质优选以maldi用基质溶液的形式与待测样品混合；所述maldi用基质溶液中maldi用基质的浓度优选为5～10，更优选为7～10mg/ml；所述待测样品与maldi用基质溶液的体积比优选为1：(0.5～2)，更优选为1：(0.5～1.5)，再优选为1：(0.8～1.2)，最优选为1：1；在本发明中，所述待测样品与maldi用基质溶液混合的方法有多种，并无特殊的限制，只要将两者混合即可，可先将待测样品滴至质谱靶板上，真空干燥后，再将maldi用基质溶液混合滴在干燥的待测样品上即可，也可先将待测样品与maldi用基质溶液直接混合后滴至质谱靶板上；最后真空干燥后，进行质谱分析；所述质谱分析优选为maldi-tof/ms；在本发明提供的实施例中质谱分析所用质谱分析仪的型号优选为bruker公司的ultraflextreme；所述质谱分析的条件优选为：质谱全扫描范围为m/z 100～1200da；激光强度为60％～90％；正离子反射模式；激光激发源是355nm和2khz，固态355nm nd：yag激光器；所述质谱分析得到的质谱数据优选为基于非靶向分析获得。
[0040]
本发明利用式(i)所示的吡啶鎓离子作为目标分析物的衍生化试剂，吡啶鎓离子可与醇羟基、酚羟基、伯胺和仲胺发生反应，从而实现对多类别神经递质小分子的衍生化，衍生化反应在常温常压下进行，反应效率高，机理明确，产物稳定，且衍生化产物中引入了正离子，可帮助衍生化产物在质谱分析时的激发，同时利用传统的maldi用基质辅助出峰，从而提高了分析物的解析/电解效率并改善了maldi分析的检出限和重复性；并且衍生化试剂与maldi试剂均为容易获取的化学试剂，可以更低成本、更清晰便捷地获得神经递质在生物样品中的成分信息。
[0041]
本发明提供的基于衍生化手段检测神经递质的方法可结合其他前处理方法应用于除体液以外其他生物样品(如组织)中的神经递质和氨基酸类小分子代谢物分析，用以评估代谢物与疾病的相关性。
[0042]
本发明提供的基于衍生化手段检测神经递质的方法还可用于保健饮品等化学样
品中神经递质和氨基酸类小分子的检测分析。
[0043]
为了进一步说明，以下结合实施例1详细描述本发明提供的衍生化方法对神经递质有良好的的检出限和重复性；结合实施例2详细描述本发明提供的衍生化方法可用于复杂生物样品中神经递质的检测。
[0044]
以下实施例中所用的试剂均为市售。
[0045]
实施例1
[0046]
步骤1)配制fmp对甲苯磺酸盐溶液作为衍生化试剂，用50％乙腈分散，浓度为1mg/ml；配制丹磺酰氯溶液作为对照方法实验用的衍生化试剂，用乙腈分散，浓度为0.8mg/ml；配制四甲基氢氧化铵溶液，用水分散，浓度为5mm；配制hcca(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质溶液，用50％乙腈分散，浓度为7mg/ml。
[0047]
步骤2)配制多巴胺(da)、肾上腺素(e)、血清素(5ht)三种神经递质单标溶液，用水分散，浓度为1μg/ml。
[0048]
步骤3)取步骤1中配制的fmp衍生化试剂溶液100μl、神经递质单标溶液50μl和水50μl，涡旋30s制成待测样品。
[0049]
步骤4)取步骤1中配制的丹磺酰氯溶液100 μl、神经递质单标溶液50μl、四甲基氢氧化铵溶液50μl，涡旋30s，随后65℃水浴中反应20min，制成对照方法待测样品。
[0050]
步骤5)将步骤3和步骤4中反应好的待测样品共6种，滴在maldi靶板上，在真空环境下干燥。
[0051]
步骤6)将步骤1中配制的hcca溶液滴在抽干样品结晶点上，在真空环境下干燥，然后进行分析。质谱分析仪为maldi-tof/ms，型号为bruker公司的ultraflextreme。质谱分析条件为：质谱全扫描范围为m/z 100～1200da，激光强度为60％，正离子反射模式。激光激发源是355nm和2khz，固态nd：yag/355nm smartbeam激光器。
[0052]
参见表1，为多巴胺、肾上腺素、血清素分别经过fmp衍生化和丹磺酰氯衍生化后在maldi-tof/ms分析中的检出限与重复性数据。
[0053]
表1
[0054][0055]
实施例2
[0056]
步骤1)配制fmp对甲苯磺酸盐溶液作为衍生化试剂，用50％乙腈分散，浓度为1mg/ml；配制hcca(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质溶液，用50％乙腈分散，浓度为7mg/ml。
[0057]
步骤2)取重约10mg脑组织到离心管中，加入50％乙腈水溶液200μl，加入1颗研磨磁珠，4℃低温研磨30秒，再涡旋振荡15分钟，然后4℃、12000r/min离心15分钟，取上清液。
[0058]
步骤3)将步骤2中得到的清液在氮吹下浓缩，将乙腈成分吹干，仅剩水相，剩余体积约20μl。为体积计算方便，本步骤得到的样品提取液可以加水和血清素/去甲肾上腺素/
γ-氨基丁酸定容到50μl，使得溶液中神经递质浓度约为500ng/ml。
[0059]
步骤4)取步骤1中配制的衍生化试剂溶液、步骤3中提取得到的样品提取液等体积混合，涡旋30s制成待测样品。
[0060]
步骤5)将步骤4中反应好的待测样品，滴在maldi靶板上，在真空环境下干燥。
[0061]
步骤6)将步骤1中配制的hcca溶液滴在抽干样品结晶点上，在真空环境下干燥，然后进行分析。质谱分析仪为maldi-tof/ms，型号为bruker公司的ultraflextreme。质谱分析条件为：质谱全扫描范围为m/z 100～1200da，激光强度为60％，正离子反射模式。激光激发源是355nm和2khz，固态nd：yag/355nm smartbeam激光器。
[0062]
参见图1，图1为血清素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)发生衍生化反应的机理图。
[0063]
图2与图3为实施例2中脑组织中血清素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图。
[0064]
图3为本发明实施例2中脑组织中血清素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图。
[0065]
图4为本发明实施例2中脑组织中γ-氨基丁酸(gaba)与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图。
[0066]
图5为本发明实施例2中脑组织中去甲肾上腺素与2-氟-1-甲基-吡啶鎓离子(fmp)衍生化反应产物的maldi质谱图。