实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的试剂盒及方法与流程

本发明属于免疫检测的，涉及实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的试剂盒及方法。

背景技术：

1、免疫荧光(immunofluorescence,if)是一种重要的免疫化学技术，可以检测和定位各种细胞以及不同类型组织中的多种抗原。与免疫组织化学(immunohistochemistry,ihc)相比，if具有更高的灵敏度且可以实现荧光信号的放大。

2、目前免疫荧光的信号放大技术有很多，包括：(1)亲和素-生物素信号放大体系(又称为生物素-亲和素系统，biotin-avidin system(bas))，但是该技术可能会受到样本中内源性生物素的干扰，从而产生污染或假阳性；(2)表位标签放大技术，该技术需要用到特制的半抗原或者表位标签，且荧光放大倍数极为有限(仅为2-4倍)；(3)酶促信号放大技术，其中的典型技术为酪氨酰信号放大技术(tsa，tyramide signal amplification)，该技术会使荧光标签以不可逆的共价键形式固定在样本上，不可逆固定的荧光标签无法通过抗原修复的过程除去，会影响样本的重复利用能力；(4)基于核酸的信号放大技术，该技术需要特殊设计的核酸辅助，且往往还需要借助核酸扩增步骤，技术难度要求高，实现过程复制。

3、金属增强荧光(metal-enhanced fluorescence,mef)是指具有特殊形貌、尺寸的金属结构能使位于其邻近的荧光分子的荧光信号得到增强的现象。mef可以方便的实现荧光的增强。mef的原理为：贵金属材料在紫外、可见光范围内有较宽的局域表面等离子体(localized surface plasmon,lsp)吸收带,当金属结构在与其lspr频率一致的光激发下,会引起表面等离子体振荡,致使金属表面产生较强的局域电磁场,改变吸附于颗粒表面及周围的荧光团的态密度,从而增强荧光强度。mef不需要特殊的仪器，不需要特殊的实验步骤，只需要荧光标签与金属纳米结构保持一定距离(5～20nm)就可以实现荧光的增强。

4、但是，mef却很少应用于免疫荧光领域，这是由于当应用贵金属纳米粒子实现荧光增强时，贵金属纳米粒子与荧光标签之间的距离是难以控制的，而mef荧光增强是距离依赖的，荧光标签与贵金属纳米粒子距离过近(<5nm)会发生荧光猝灭(fluorescencequenching)，而当荧光标签与贵金属纳米粒子距离过远(>20nm)则几乎不发生荧光增强。

5、香港大学的研究者们利用双二抗体系(一种二抗标记金纳米，另一种二抗标记荧光标签)实现了荧光的3倍增强(chemical communications,2019,55(19):2761-2764)。但是这种荧光增强方法增强荧光的效果是不可控的，因为两种二抗是随机结合的，如果某些一抗只结合金纳米标记的二抗就会发生假阴性的情况；并且，如果某些一抗只结合荧光标签标记的二抗那么荧光得不到增强；另外，如果与一抗结合的荧光标签标记的二抗和金纳米标记的二抗距离不恰当也会导致荧光猝灭或者无法荧光增强的问题。

6、通过制备贵金属纳米基底可以更好地实现荧光的稳定增强，且基底表面距离和形态恰当的金属纳米粒子可以同时利用局域表面等离激元共振(lspr，localized surfaceplasmon resonance)效应和避雷针效应(lightning rod effect)使荧光增强的倍数大大提高。但是，目前贵金属纳米基底还无法应用于免疫荧光领域。这是由于免疫荧光的样本是预先固定在玻片上的，且样本厚度一般在3μm(3000nm)以上，这种厚度即使将样本固定在贵金属纳米基底上也无法实现荧光增强。

7、但是免疫荧光检测的是样本表面的抗原，因此，如果有办法将样本表面待检测的信息转印到贵金属纳米基底表面，并将距离控制恰当，就可以用贵金属纳米基底实现高灵敏度的原位荧光检测。

8、盛滔等人在《基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法及试剂盒》(申请号：cn202111563604.3)中提出了在样本表面原位生长贵金属纳米粒子从而实现免疫荧光增强的技术，但是该技术对于样本是具有破坏性的，用该方法进行免疫荧光增强后样本无法再进行回收利用。

9、因此，亟待寻找出一种在不破坏样本的前提下，可以同时实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的试剂盒及方法。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、如前所述，现有技术中存在以下缺陷：由于样本太厚(厚度为微米级别，远大于实现金属荧光增强的距离(2.5～25nm))，贵金属纳米基底无法应用于免疫荧光领域，无法实现免疫荧光增强；难以将样本信息从样本表面转移到贵金属纳米基底表面并实现免疫荧光增强；荧光标签与贵金属纳米基底的距离难以控制；虽然样本表面原位生长的金纳米可以利用金属增强荧光(mef)效应实现免疫荧光增强，但会导致样本被破坏，使样本无法循环使用。

3、针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种可以用于免疫荧光领域中可以将样本表面的信息转印到贵金属纳米基底表面并在所述贵金属纳米基底上实现免疫荧光增强的方法。

4、用于解决问题的方案

5、本发明在第一方面提供了一种实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

6、a)特异性反应物，所述特异性反应物包含(1)结合物质、(2)含剪切位点的接头和(3)生物素，所述结合物质和所述生物素分别与所述含剪切位点的接头连接；

7、b)荧光复合物，所述荧光复合物包含脱硫生物素、亲和素、免疫球蛋白结合蛋白、免疫球蛋白和荧光标签；

8、c)分子剪刀，所述分子剪刀剪切所述接头中的所述剪切位点；以及，

9、d)转印基底，所述转印基底表面修饰有纳米粒子。

10、在一些实施方案中，所述结合物质为抗体、抗体片段或适配体；在一些优选的实施方案中，所述结合物质为抗体；

11、在一些实施方案中，所述含剪切位点的接头的剪切位点包含二硫键，并且所述剪切位点被所述分子剪刀特异性剪切、导致所述剪切位点发生断裂。

12、在一些实施方案中，所述免疫球蛋白结合蛋白为选自由蛋白a、蛋白g和蛋白a/g组成的组中的任一种；所述免疫球蛋白为选自由igm、ige、iga、igd、igg或其任何类似物或衍生物组成的组中的任一种；所述荧光标签为选自由荧光素、罗丹明、alexa fluor类、dylight fluor类、atto类染料或其任何类似物或衍生物组成的组中的任一种；

13、在一些可替换的实施方案中，所述免疫球蛋白结合蛋白和所述免疫球蛋白可替换为高分子聚合物；在一些优选的实施方案中，所述高分子聚合物为聚乙二醇(peg)；在一些更优选的实施方案中，所述高分子聚合物为分子量为2000～15000道尔顿之间的聚乙二醇。

14、在一些实施方案中，所述分子剪刀为还原剂；在一些优选的实施方案中，所述分子剪刀包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇和三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐中的一种或多种；在一些更优选的实施方案中，所述分子剪刀为三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐。

15、在一些实施方案中，所述转印基底由可渗水的材料制成；在一些优选的实施方案中，所述转印基底由纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜、聚碳酸酯膜、聚四氟乙烯膜、水凝胶和多孔材料中的一种或多种制成；在一些更优选的实施方案中，所述转印基底由混合纤维素膜制成。

16、在一些实施方案中，多个由脱硫生物素、免疫球蛋白结合蛋白、带有荧光标签的免疫球蛋白组成的复合物与亲和素和生物素共同构成了空间隔栏；所述空间隔栏使所述荧光标签与所述转印基底表面修饰的粒子保持合适的距离，从而避免发生荧光猝灭；在一些优选的实施方案中，所述合适的距离为2.5～25nm；在一些更优选的实施方案中，所述合适的距离为5～20nm。

17、在一些实施方案中，其中所述修饰通过在所述转印基底表面还原所述纳米粒子和在转印基底表面培养所述还原后的纳米粒子而实现；在一些优选的实施方案中，所述转印基底表面修饰的纳米粒子为贵金属纳米粒子；在一些更优选的实施方案中，所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子。

18、本发明的第二方面提供了一种实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的方法，所述方法利用如本发明第一方面所述试剂盒进行荧光复合物转印和免疫荧光增强，所述方法包括以下步骤：

19、1)孵育特异性反应物的步骤：向待测样本中施加特异性反应物并进行孵育，使所述特异性反应物中包含的结合物质与所述待测样本中的目标分析物结合；

20、2)孵育荧光复合物并通过竞争性置换反应与特异性反应物结合的步骤：加入荧光复合物并进行孵育，所述荧光复合物中的一部分被所述特异性反应物中包含的生物素竞争性置换，得到置换后的荧光复合物；

21、3)剪切的步骤：加入分子剪刀，对步骤2)得到的置换后的荧光复合物中包含的剪切位点进行剪切，释放带有巯基的荧光复合物；

22、4)覆盖转印基底的步骤：将转印基底覆盖在步骤3)得到的带有巯基的荧光复合物上，使所述带有巯基的荧光复合物通过硫金键与转印基底表面修饰的纳米粒子结合，从而实现荧光复合物的转印；

23、5)检测步骤：对实现了荧光复合物转印的转印基底进行成像。

24、在一些具体的实施方案中，其中所述检测步骤中所采用的检测方法为免疫荧光检测。

25、在一些具体的实施方案中，在所述孵育特异性反应物的步骤前，还包括对待测样本预处理的步骤；

26、在一些任选地实施方案中，所述预处理包括脱蜡、抗原修复、封闭内源性生物素、封闭非特异性结合位点中的一种或多种。

27、发明的效果

28、由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

29、1，本发明提供的实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的试剂盒及方法使荧光标签和贵金属纳米基底可以保持在适于免疫荧光增强的距离。

30、2.本发明提供的实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的试剂盒及方法可以利用mef实现免疫荧光增强，但又不会破坏样本，并且所述样本可以回收利用。

31、3.本发明提供的实现荧光复合物转印和免疫荧光增强的试剂盒及方法既可以实现样本表面信息的转印，也可以在转印的基底上进行实验，而不影响原始样本。