胶体金试纸的制备与应用的制作方法

1.本发明属于免疫胶体金技术领域，具体涉及胶体金试纸的制备与应用。


背景技术：

2.免疫胶体金技术的特点是简便、快速、无需辅助设备。该技术目前发展快速，在生物检测领域有着广泛的应用。经典的免疫胶体金技术包含样本垫，结合垫，包被膜，吸水垫和pvc底板。包被膜是预先在硝酸纤维素膜上包被蛋白等，样本和结合垫中的胶体金标记物先反应，之后在硝酸纤维素膜上侧向流动的过程中跟硝酸纤维素上的包被蛋白完成反应，根据包被线条的情况判断样本中是否有待检物质。
3.免疫胶体金技术的缺点是灵敏度不足，异嗜性抗体干扰。灵敏度跟多种因素相关，包括样本的流动速度、反应时间、标记物、背景、新的生物放大系统等，对于灵敏度要求高的一些项目比如感染性项目，往往因为灵敏度低造成漏检，带来应用的困惑。在检测中，特别是双抗体夹心法检测中，由于异嗜性抗体的存在，往往造成假阳性，常见的消除异嗜性抗体的方法是在样本垫中添加抗异嗜性抗体，样本垫对初始的样本进行初步过滤，只是过滤了较为明显的絮状物或颗粒明显物质，对异嗜性抗体反应不充分，因此对异嗜性抗体引起的干扰清除不彻底。
4.另外研究者尝试多种方法提升免疫胶体金的灵敏度。申请号为200880132189.2的专利“免疫层析测试中信号放大的方法以及使用该方法的免疫层析试剂盒”利用标记物不同，进行二种偶联物的级联反应实现信号放大，进而提升检测的灵敏度。申请号为201210507386.6“一种提高胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度的方法”的专利是在反应后的检测试纸上滴加透明化试剂，降低试纸条的背景来提升灵敏度。申请号为201710046695.0“一种高灵敏度胶体金试纸及其制备方法与应用”的专利在样本垫中添加亲和素，在结合垫中添加生物素标记的抗体，利用生物素和亲和素系统进行灵敏度提高。上述专利利用标记物级联放大，降低背景信号，生物素亲和素放大系统的方法进行灵敏度提升，没有涉及样本反应时间和流动速度等侧向流关键的物理参数的优化，且现有的免疫层析试纸条设置上也存在不足。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供胶体金试纸的制备与应用。
6.本发明提供了胶体金试纸，其包括顺次设置的硝酸纤维素膜、样品垫、过滤垫、结合垫、反应垫及吸水垫。
7.所述过滤垫的制备原料包括过滤垫基质和过滤垫处理液：所述过滤垫基质选自玻璃纤维或聚酯纤维；所述过滤垫处理液包括水和tris、酪蛋白、牛血清白蛋白和抗异嗜性抗体。
8.所述反应垫的制备原料包括反应垫基质和反应垫处理液：所述反应垫基质包括聚酯玻纤；所述反应垫处理液包括水和疏水性表面活性剂、亲水性表面活性剂、三羟甲基氨基
甲烷、氨基酸、酪蛋白、明胶和牛血清白蛋白。
9.本发明中，所述的硝酸纤维素膜包被有质控抗体和目标蛋白抗体。进一步的，所述的质控抗体包括igg抗体，所述igg抗体包括羊抗鼠igg、羊抗兔igg、羊抗人igg、羊抗鸡igg、兔抗人igg、抗羊igg、抗犬igg、抗鼠igg、抗鸡igg、抗牛igg、抗猪igg；本发明实施例中，所述质控抗体使用羊抗鼠igg抗体，浓度为1.5mg/ml。
10.本发明中，所述目标蛋白抗体选择与检测目标相关，当检测目标发生改变时，其需要根据目标进行适应性改变。所述的检测目标包括但不限于病毒、细菌、真菌、动物；所述的病毒包括但不限于疱症病毒、乙肝病毒、流感病毒、麻疹病毒、sars病毒、脊髓灰质炎病毒、登革热病毒、巨细胞病毒、新冠病毒；所述新冠病毒的目标蛋白抗体包括新冠n蛋白抗体和新冠s蛋白抗体；本发明采用新冠n蛋白鼠源igg抗体为目标蛋白抗体，用于新冠病毒的检测，浓度为1.0μl/cm。
11.本发明中，所述的样品垫的材质选自：聚酯玻纤、玻璃纤维、无纺布。本发明使用聚酯玻纤作为样品垫材质，更利于样品的在一定的速度和浓度下均匀层析流向硝酸纤维素膜。
12.本发明中，所述结合垫的材质选自：玻璃纤维、无纺布、无尘纸、反应膜聚酯膜或高分子复合物。本发明使用玻璃纤维作为结合垫的材质，其与本发明所述的构成胶体金试纸的其他必要技术特征一起，用于特异性强、灵敏度高的胶体金试纸的制备。
13.本发明中，所述过滤垫处理液包括水和(w/w)：6.0％tris、0.2％酪蛋白、0.1％牛血清白蛋白和0.005％抗异嗜性抗体，ph 8.3。
14.所述反应垫处理液包括水和(w/w)：0.01～0.5％疏水性表面活性剂、0.01～0.5％亲水性表面活性剂、6.0％三羟甲基氨基甲烷、2％氨基酸、0.5％酪蛋白、0.2％明胶和0.1％牛血清白蛋白，ph 8.3。
15.进一步的，所述抗异嗜性抗体优选跟使用包被标记同源抗体。实验结果表明，与包被标记同源抗体的抗异嗜性抗体的使用可消除或减少非特异性反应。所述抗异嗜性抗体选自抗鼠源抗体，抗兔源性抗体，抗羊源性抗体或抗鸡源性抗体。更进一步的，本发明优选抗鼠源抗体，其与鼠igg抗体配套使用，当体系igg抗体发生改变时，则需要替换相应的抗异嗜性抗体。
16.本发明中，所述的表面活性剂包括亲水表面活性剂和疏水表面活性剂。本发明中，hbl表示了亲水基团和亲油基团的亲水亲油平衡值，表面活性剂的hbl值越大，表示分子亲水性越强。
17.本发明中，所述亲水性表面活性剂的hlb值＞24，其包括纯月桂基硫酸钠、n-十六烷基-n-乙基吗啉基乙基硫酸钠阳离子、乙二胺-草酸盐嵌段共聚物(1307)和(聚氧乙烯—聚氧丙烯)嵌段共聚物(rf68)，优选rf68，其使用浓度0.01～0.5％。
18.本发明中，所述疏水性表面活性剂的hlb＜5，其包括单硬脂酸甘油酯、羟基化羊毛脂、丙二醇脂肪酸酯、失水山梨醇单油酸酯、二乙二醇脂肪酸酯、有辛基酚乙氧基化物(ca210)和山梨糖醇酐单硬脂酸酯(60)，优选60，其使用浓度0.01～0.5％。
19.本发明中，所述的氨基酸包括甘氨酸和带电荷的极性氨基酸；所述的极性氨基酸
包括：天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸。本发明优选甘氨酸。实验表明，氨基酸的加入增加了反应的敏感性。
20.本发明中，当所述过滤垫处理液为(w/w)：6.0％tris、0.2％酪蛋白、0.1％牛血清白蛋白和0.005％抗鼠源抗体，ph 8.3；所述反应垫处理液为(w/w)：0.01％(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、0.5％山梨糖醇酐单硬脂酸酯、6.0％三羟甲基氨基甲烷、2％甘氨酸、0.5％酪蛋白、0.2％明胶和0.1％牛血清白蛋白，ph 8.3；制得的试纸条的性能更优秀。
21.本发明在实验中发现，本发明所述胶体金试纸条性能的提高，与试纸条中每个组成部分的材料选择和试剂处理步骤密切相关，多种因素之间互相支持，相互作用，最终从整体上是使制得的胶体金试纸特异性强、灵敏度高。
22.本发明提供了胶体金试纸的制备方法，其步骤包括：
23.步骤1、将胶体金与标记物n蛋白抗体偶联，得到胶体金-标记抗体偶联物；
24.步骤2、将所述胶体金-标记抗体偶联物喷涂在结合垫上；
25.步骤3、将过滤垫浸润于所述过滤垫处理液后干燥；
26.步骤4、将反应垫浸润于所述反应垫处理液后干燥；
27.步骤5、在pvc底板上铺贴硝酸纤维素膜干燥后，在其上依次铺贴样品垫、过滤垫、结合垫、反应垫及吸水垫，制成胶体金试纸。
28.本发明所述的制备方法中，步骤1胶体金的平均直径为20～60nm；所述胶体金制备方式为：在煮沸的四氯金酸溶液中通过加入0.01％(质量单位)的柠檬酸三钠溶液。
29.本发明步骤1中，所述的胶体金需使用0.2m k2co3调节ph到8.0再加入标记物n蛋白抗体，所述标记物n蛋白抗体的浓度为10μg/ml。待胶体金与标记物n蛋白抗体反应30min后，用浓度为0.01g/ml的bsa封闭30min，即得到胶体金-标记抗体偶联物。
30.本发明所述的制备方法，所述得到胶体金-标记抗体偶联物保存于含有5mg/ml bsa和1mg/ml精氨酸的0.05m ph 7.4的pb中。
31.本发明步骤2中，所述胶体金-标记抗体偶联物在结合垫上喷涂浓度为5.0μl/cm。
32.本发明中，所述的干燥指在室温或37℃下干燥，适宜的温度有利于材料活性的保持。
33.本发明提供了所述的胶体金试纸和所述的制备方法制得的胶体金试纸在制备病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
34.进一步的，本发明还提供了病毒检测方法，其包括使用本发明所述的胶体金试纸。其检测方式可以为目测也可以为机读，本发明对此不做限定。
35.本发明提供了一种胶体金试纸，其通过增加特殊处理的反应垫和过滤垫，从整体上使制得的胶体金试纸特异性强、灵敏度高。本发明的胶体金试纸中，过滤垫添加抗异嗜性抗体消除异嗜性抗体的干扰提升检测的特异性，并且对反应垫进行特殊处理，使反应垫亲水性能和液体浸润时间受到控制。从而实现对侧向流中样本反应时间和流动速度物理参数的控制来提高灵敏度。该制备方法简单，制得的胶体金试纸特异性强、灵敏度高且可用性良好。
附图说明
36.图1示胶体金试纸示意图，其中，1为样本垫，2为过滤垫，3为结合垫，4为反应垫，5
为硝酸纤维素膜，6为吸水垫。
具体实施方式
37.本发明提供了胶体金试纸的制备与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
38.本发明中，各个技术特征在功能上相互支持，存在相互作用，它们作为一个整体对本发明的技术效果产生影响，因此作为一个整体进行保护。
39.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
40.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
41.实施例1胶体金试纸制备条件1
42.(1)制备胶体金：根据frens方法(frens，g.，preparation of gold dispersions varying particle size：controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions in nature：physical science241(1973)，20～22)，在煮沸的四氯金酸溶液中通过加入0.01％(质量单位)的柠檬酸三钠溶液来制备具有平均颗粒直径约40nm的胶体金。
43.(2)制备胶体金标记抗体复合物
44.取10ml胶体金，使用0.2m k2co3调节所需的ph值到8.0，并加入标记物n蛋白抗体100μg，反应30min，之后加入0.1g bsa进行封闭30min，将反应物离心弃上清，得到胶体金-标记抗体偶联物。保存在2ml 0.05m pb ph7.4中(含有5mg/ml bsa和1mg/ml精氨酸)。4度备用。
45.(3)制备结合垫
46.将胶体金标记抗体偶联物以5.0μl/cm喷涂在玻璃纤维垫30cm
×
0.5cm上，37度干燥备用。
47.将羊抗鼠igg抗体、新冠n蛋白鼠源igg抗体以1.5mg/ml，1.0μl/cm的量包被在硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在pvc底板上，37度干燥备用。在干燥后的带有pvc底板的硝酸纤维素膜上，依次粘贴上样品垫、涂有标记抗体的结合垫，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水垫，各组分之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板，用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，放入检测卡中，在样品垫一端加入待测样本，15分钟后观察结果，检测线与质控线均出现颜色线条记录为阳性，检测线不出现颜色线条记录为阴性。
48.实施例2胶体金试纸制备条件2
49.(1)制备胶体金：根据frens方法(frens，g.，preparation of gold dispersions varying particle size：controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions in nature：physical science241(1973)，20～22)，在煮沸的四氯金酸溶液中通过加入0.01％(质量单位)的柠檬酸三钠溶液来制备具有平均颗粒直径约40nm的胶体金。
50.(2)制备胶体金标记抗体复合物
51.取10ml胶体金，使用0.2m k2co3调节所需的ph值到8.0，并加入标记物n蛋白抗体100μg，反应30min，之后加入0.1g bsa进行封闭30min，将反应物离心弃上清，得到胶体金-标记抗体偶联物。保存在2ml 0.05m pb ph7.4中(含有5mg/ml bsa和1mg/ml精氨酸)。4度备用。
52.(3)制备结合垫
53.将胶体金标记抗体偶联物以5.0μl/cm喷涂在玻璃纤维垫30cm
×
0.5cm上，37度干燥备用。
54.(4)过滤垫处理液的配制(w/w)：
[0055][0056]
用1m的盐酸调节ph为8.3
±
0.1
[0057]
(5)制备过滤垫：长度30cm
×
宽度0.5cm的玻璃纤维垫浸泡在3ml的过滤垫处理液中，待聚酯玻纤完全湿润后取出，37℃烘干后室温密封保存备用。
[0058]
(6)反应垫处理液的配制(w/w)：
[0059][0060]
用1m的盐酸调节ph为8.3
±
0.1
[0061]
(7)制备反应垫：将厚度为2mm；长度30cm
×
宽度1cm的聚酯玻纤垫浸泡在5ml的反应垫处理液中，待聚酯玻纤完全湿润后取出，37℃烘干后室温密封保存备用。
[0062]
将羊抗鼠igg抗体、新冠n蛋白鼠源igg抗体以1.5mg/ml，1.0μl/cm的量包被在硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在pvc底板上，37度干燥备用。在干燥后的硝酸纤维素膜上，依次粘贴上样品垫、含有抗鼠源性抗体的过滤垫、涂有标记抗体的结合垫、处理后的反应垫，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水垫，各组分之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板，用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，放入检测卡中，在样品垫一端加入待测样本，15分钟后观察结果，检测线与质控线均出现颜色线条记录为阳性，检测线不出现颜色线条记录为阴性。
[0063]
实施例3胶体金试纸制备条件3
[0064]
(1)制备胶体金：根据frens方法(frens，g.，preparation of gold dispersions varying particle size：controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions in nature：physical science241
(1973)，20～22)，在煮沸的四氯金酸溶液中通过添加0.01％(质量单位)的柠檬酸三钠溶液来制备具有平均颗粒直径约40nm的胶体金。
[0065]
(2)制备胶体金标记抗体复合物
[0066]
取10ml胶体金，使用0.2m k2co3调节所需的ph值到8.0，并加入标记物n蛋白抗体100μg，反应30min，之后加入0.1g bsa进行封闭30min，将反应物离心弃上清，得到胶体金-标记抗体偶联物。保存在2ml 0.05m pb ph7.4中(含有5mg/ml bsa和1mg/ml精氨酸)。4度备用。
[0067]
(3)制备结合垫
[0068]
将胶体金标记抗体偶联物以5.0μl/cm喷涂在玻璃纤维垫30cm
×
0.5cm上，37度干燥备用。
[0069]
(4)过滤垫处理液的配制(w/w)：
[0070][0071]
用1m的盐酸调节ph为8.3
±
0.1
[0072]
(5)制备过滤垫：长度30cm
×
宽度0.5cm的玻璃纤维垫浸泡在3ml的过滤垫处理液中，待聚酯玻纤完全湿润后取出，37℃烘干后室温密封保存备用。
[0073]
(6)反应垫处理液的配制(w/w)：
[0074][0075]
用1m的盐酸调节ph为8.3
±
0.1
[0076]
(7)制备反应垫：将厚度为2mm；长度30cm
×
宽度1cm的聚酯玻纤垫浸泡在5ml的反应垫处理液中，待聚酯玻纤完全湿润后取出，37℃烘干后室温密封保存备用。
[0077]
将羊抗鼠igg抗体、新冠n蛋白鼠源igg抗体以1.5mg/ml，1.0μl/cm的量包被在硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在pvc底板上，37度干燥备用。在干燥后的硝酸纤维素膜上，依次粘贴上样品垫、含有抗鼠源性抗体的过滤垫、涂有标记抗体的结合垫、处理后的反应垫，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水垫，各组分之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板，用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，放入检测卡中，在样品垫一端加入待测样本，15分钟后观察结果，检测线与质控线均出现颜色线条记录为阳性，检测线不出现颜色线条记录为阴性。
[0078]
实施例4胶体金试纸制备条件4
[0079]
(1)制备胶体金：根据frens方法(frens，g.，preparation of gold dispersions varying particle size：controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions in nature：physical science241(1973)，20～22)，在煮沸的四氯金酸溶液中通过添加0.01％(质量单位)的柠檬酸三钠溶液来制备具有平均颗粒直径约40nm的胶体金。
[0080]
(2)制备胶体金标记抗体复合物
[0081]
取10ml胶体金，使用0.2m k2co3调节所需的ph值到8.0，并加入标记物n蛋白抗体100μg，反应30min，之后加入0.1g bsa进行封闭30min，将反应物离心弃上清，得到胶体金-标记抗体偶联物。保存在2ml 0.05m pb ph7.4中(含有5mg/ml bsa和1mg/ml精氨酸)。4度备用。
[0082]
(3)制备结合垫
[0083]
将胶体金标记抗体偶联物以5.0μl/cm喷涂在玻璃纤维垫30cm
×
0.5cm上，37度干燥备用。
[0084]
(4)过滤垫处理液的配制(w/w)：
[0085][0086]
用1m的盐酸调节ph为8.3
±
0.1
[0087]
(5)制备过滤垫：长度30cm
×
宽度0.5cm的玻璃纤维垫浸泡在3ml的过滤垫处理液中，待聚酯玻纤完全湿润后取出，37℃烘干后室温密封保存备用。
[0088]
(6)反应垫处理液的配制(w/w)：
[0089][0090]
用1m的盐酸调节ph为8.3
±
0.1
[0091]
(7)制备反应垫：将厚度为2mm；长度30cm
×
宽度1cm的聚酯玻纤垫浸泡在5ml的反应垫处理液中，待聚酯玻纤完全湿润后取出，37℃烘干后室温密封保存备用。
[0092]
将羊抗鼠igg抗体、新冠n蛋白鼠源igg抗体以1.5mg/ml，1.0μl/cm的量包被在硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在pvc底板上，37度干燥备用。在干燥后的硝酸纤维素膜上，依次粘贴上样品垫、涂有标记抗体的结合垫、处理后的反应垫，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水垫，各组分之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板，用切条机将粘贴好的塑料板纵向
切成4mm宽的免疫试纸条，放入检测卡中，在样品垫一端加入待测样本，15分钟后观察结果，检测线与质控线均出现颜色线条记录为阳性，检测线不出现颜色线条记录为阴性。
[0093]
实施例5胶体金试纸制备条件5
[0094]
(1)制备胶体金：根据frens方法(frens，g.，preparation of gold dispersions varying particle size：controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions in nature：physical science241(1973)，20～22)，在煮沸的四氯金酸溶液中通过添加0.01％(质量单位)的柠檬酸三钠溶液来制备具有平均颗粒直径约40nm的胶体金。
[0095]
(2)制备胶体金标记抗体复合物
[0096]
取10ml胶体金，使用0.2m k2co3调节所需的ph值到8.0，并加入标记物n蛋白抗体100μg，反应30min，之后加入0.1g bsa进行封闭30min，将反应物离心弃上清，得到胶体金-标记抗体偶联物。保存在2ml 0.05m pb ph7.4中(含有5mg/ml bsa和1mg/ml精氨酸)。4度备用。
[0097]
(3)制备结合垫
[0098]
将胶体金标记抗体偶联物以5.0μl/cm喷涂在玻璃纤维垫30cm
×
0.5cm上，37度干燥备用。
[0099]
(4)反应垫处理液的配制(w/w)：
[0100][0101]
用1m的盐酸调节ph为8.3
±
0.1
[0102]
(5)制备反应垫：将厚度为2mm；长度30cm
×
宽度1cm的聚酯玻纤垫浸泡在5ml的反应垫处理液中，待聚酯玻纤完全湿润后取出，37℃烘干后室温密封保存备用。
[0103]
将羊抗鼠igg抗体、新冠n蛋白鼠源igg抗体以1.5mg/ml，1.0μl/cm的量包被在硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在pvc底板上，37度干燥备用。在干燥后的硝酸纤维素膜上，依次粘贴上样品垫、涂有标记抗体的结合垫、处理后的反应垫，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水垫，各组分之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板，用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，放入检测卡中，在样品垫一端加入待测样本，15分钟后观察结果，检测线与质控线均出现颜色线条记录为阳性，检测线不出现颜色线条记录为阴性。
[0104]
结果如下：
[0105]
[0106][0107]
对实施例1～实施例5中制备的胶体金试纸在浓度不同检测目标(新冠n蛋白或称n蛋白)及不同干扰背景下的灵敏度进行检测。样本稀释液中加入不同浓度n蛋白制成浓度不同的检测目标；样本稀释液中加入不同浓度hama(hama为人抗鼠抗体)制成不同hama浓度的干扰样本；样本稀释液为：0.02m tris-hcl ph 7.4，0.2％tritonx-100(w/w)，0.9％nacl(w/w)。
[0108]
结果分析：通过和对照方案比，对比方案3和5，过滤垫添加特异性改进明显；对比方案3和4比对，特定氨基酸类的加入增加了反应的敏感性；对比方案2和3不同亲水疏水处理对检测结果的影响；比对方案1和3，常规层析技术方案跟本发明的技术方案比对，通过添加处理后的过滤垫和反应垫，进而提升检测的灵敏度约20倍。
[0109]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。