一种Halo-tag标记和3D超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法

一种halo-tag标记和3d超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法
技术领域
1.本发明属于分子标记技术和显微成像技术领域，尤其涉及一种halo-tag标记和3d超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法。


背景技术：

2.植物的原生质体细胞指的是去除细胞壁之后的所有内含物，它既保持了植物细胞的一切生理活性，并且还排除了较厚细胞壁的存在和干扰，在分子标记和光学成像研究方面，具有和动物细胞类似的优势，可以迅速进行反应、代谢和表达，极大地缩短了实验周期，并能获得可靠的活体实验数据，因此目前被广泛应用于植物细胞生物学的研究中。新型halo-tag标记技术是指halo-tag蛋白和外源halo-tag配基之间共价结合的化学反应，它允许研究人员通过基因工程对目标分子进行特异性标记，同时还能根据实验目的需要，来添加含有不同功能基团的halo-tag配基。halo-tag标记技术克服了传统分子标记的局限性，反应十分迅速，实验简单只需要构建单一载体，就能实现多种实验目的，还可以与不同的超分辨显微成像系统、以及其他标记技术进行联合应用，因此该技术在细胞生物学中有着广泛的应用。
3.以往开展活体状态下的细胞结构和功能研究，主要是利用传统荧光蛋白(gfp/mcherry)、有机染料或者量子点标记的方法，然而这些标记方法具有非常容易漂泊、发射光谱较宽且特异性差等缺点，限制了它们在活细胞超分辨成像领域中的应用，更不能精确的反映真实状态下分子的结构和分布特征，因此也就阻碍了细胞核内单分子的超分辨结构和功能机理的深入探索和研究。
4.已有报道通过对烟草和杨树的原生质体作为研究对象，以halo-tag标记技术作为手段来研究分子的定位情况，但尚未扩展到活细胞超分辨成像领域，并且也没有利用模式植物拟南芥为研究对象的工作，更没有在单分子水平上进行定量分析目标蛋白的精细结构和分布特征。因此，现有技术中缺少一种利用模式植物拟南芥原生质体作为研究对象，利用halo-tag技术来快速对活细胞核内目标分子进行特异标记的方法，尤其是缺少结合3d超高分辨成像系统来对核内蛋白的结构、定位和分布进行精细观察的方法。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用新型halo-tag标记和3d超分辨成像技术观察植物活细胞核蛋白的方法，能够长时间、实时多角度成像和定量分析植物活细胞核蛋白的定位特征、精细结构特点和荧光强度分布。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种halo-tag标记和3d超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一：获取halo-tag转基因植株；步骤二：制备和培养植物原生质体细胞；步骤三：halo-tag荧光染料的孵育和漂洗；步骤四：3d-sim超分辨成像观察；步骤五：利用软
件分析图像和统计相关参数。
8.优选的，所述步骤一具体为：将halo-tag基因序列连接到带有目的基因的真核表达载体pcambia2300-目的基因中，获得pcambia2300-目的基因-halotag，将pcambia2300-目的基因-halotag侵染进入植物中，获得带有halo-tag标签的转基因植株。
9.优选的，所述目的基因包括med18。
10.优选的，所述halo-tag基因序列是以ph6htnt7载体为模板，pcr扩增获得。
11.优选的，所述步骤二中培养植物原生质体细胞具体为：恒温避光培养。
12.优选的，所述步骤三中孵育具体为：利用halo-tagtmr荧光染料进行染色，混匀后，避光28-37℃孵育15-60min。
13.优选的，所述步骤三中漂洗具体为：采用干净培养基清洗后，避光条件下采用脱色摇床孵育，所述脱色摇床的转速为40rpm-45rpm。
14.优选的，所述步骤四具体为：对标记后的原生质体细胞核使用dapi荧光染料进行染色，洗涤后使用结构光超分辨显微镜，用3d成像模式，调整激光强度为4-6％、曝光时间在60ms以下，选取405和568nm双通道激发光对染色后的原生质体进行观察。
15.优选的，所述步骤五具体为：对获得的超分辨图像，利用imagej、imaris、origin和prism 8软件提取获得的参数信息，根据目标分子的大小建立单分子的模拟斑点和量化分析，进一步展示活细胞核内目标分子的特异性结构特点和分布特征信息。
16.优选的，所述植物包括拟南芥、烟草和杨树。
17.本发明的有益效果：
18.本发明采用了新型halo-tag标记方法，既能保证遗传标记的特异性，还能保持有机染料能发射更多光子数的优势，最主要是halo-tag蛋白与halo-tag荧光配基之间是共价结合的有机反应，保证了有机染料结合的稳定和不可逆性，本发明方法可以长时间的、特异性的标记植物细胞核内蛋白质，抗猝灭和漂白能力大大提高，并且标记过程非常十分简单和快速。
19.本发明采用了deltavision omx结构光照明的超高分辨率显微成像系统，其中选择3d成像模式，通过记录3个角度、5个相位，设置0.125μm的间隔，拍摄1μm厚度，共135张原始图像，最终通过不同的算法重构出sim超分辨成像图片，从而实现植物细胞核内的目标分子的长时间追踪和精细定位观察。
20.本发明标记和成像方法是首次在模式植物拟南芥活细胞样品中实现，能够在活体条件下，真实地反应单个分子的分布和结构特点，并最终获得植物细胞核内的单分子超高分辨图像。
21.本发明方法利用四种不同的软件，分别进行图像的处理、模拟、数据的分析和拟合，来精确地识别细胞核内单分子的特征，并从多个不同的角度、进一步量化目标分子的精细结构和分布特征。
22.本发明方法重复性高，操作简单，并在不同植物物种间广泛适用，为活体状态下单分子水平的时空特异超分辨成像研究提供了一种快速的方法。
附图说明
23.图1是本发明方法的实验流程图；
24.图2是本发明的标记和成像原生质体细胞核的宽场荧光图像；
25.图3是本发明通过3d超分辨显微镜观察原生质体核蛋白的动态效果图像；
26.图4是本发明利用image j和imaris软件分析的原生质体核蛋白的荧光分布模拟图；
27.图5是本发明利用origin和prism 8软件对原生质体核蛋白的体积、椭圆率、像素点和荧光强度的高斯拟合柱状图；
28.图6和图7是采用相同材料用mcherry标记的超分辨共聚焦airyscan成像下的效果。
具体实施方式
29.本发明提供了一种观察植物活细胞核蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一：获取halo-tag转基因植株；步骤二：制备和培养植物原生质体细胞；步骤三：halo-tag荧光染料的孵育和漂洗；步骤四：3d-sim超分辨成像观察；步骤五：利用软件分析图像和统计相关参数。
30.本发明观察植物活细胞核蛋白的方法的流程图如图1所示。在本发明中，所述获取halo-tag转基因植株的步骤优选的为：将halo-tag基因序列通过同源重组的方式连接到带有目的基因的真核表达载体pcambia1300-目的基因中，获得pcambia1300-目的基因-halotag，将pcambia1300-目的基因-halotag侵染进入植物中，获得带有halo-tag标签的转基因植株。本发明所述halo-tag基因序列优选的是以ph6htnt7载体为模板，pcr扩增获得。所述pcr扩增所用的引物序列优选的为：f：ggaggaggtactacattgtctagagtcgacatggcagaaatcggtact(seq id no.1)；r：taccgatgatacgaacgaaagctctgcagttagccggaaatctcgagcgt(seq id no.2)；所述pcr扩增的体系优选的为：模板1μl，引物各1μl，2
×
premix taq
tm
10μl，ddh2o 7μl，所述pcr扩增的反应程序优选的为：退火温度设置为55℃30sec，共35次循环，其余按照本领域常规pcr的正常程序即可。在本发明中，将pcambia1300-目的基因-halotag导入植物中所用的方法优选的为农杆菌侵染法，本发明对于农杆菌侵染的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规农杆菌侵染方法均可。在本发明中，所述目的基因优选的包括med18。
31.在本发明中，制备植物原生质体细胞时，优选的采用纤维素酶和离析酶配制的酶解液进行植物原生质体细胞的制备，制备获得植物原生质体细胞后，优选的需恒温避光培养，所述培养的温度优选为27-29℃，更优选为28℃。
32.在本发明中，所述步骤三中孵育优选的为：利用halo-tag tmr荧光染料进行染色，混匀后，避光28-37℃孵育15-60min。在本发明中，所述利用halo-tag tmr荧光染料进行染色混匀后，避光孵育的温度优选为28℃，孵育的时间优选为15min，在此种孵育条件下染色效果最好。本发明对于halo-tag tmr荧光染料的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。孵育结束后，所述漂洗优选的为：采用干净培养基清洗后，避光条件下采用脱色摇床孵育，所述脱色摇床的转速优选为40rpm-45rpm，更优选为42rpm-43rpm。在本发明中，所述干净培养基清洗的次数优选为3次。
33.本发明所述步骤四优选的为：对标记后的原生质体细胞核使用dapi荧光染料进行染色，洗涤后使用结构光超分辨显微镜，用3d成像模式，调整激光强度为4-6％、曝光时间在60ms以下，选取405和568nm双通道激发光对染色后的原生质体进行观察。本发明对于dapi荧光染料的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述超分辨显微镜优选的为型号是deltavision omx结构光照明超分辨显微镜。
34.本发明所述步骤五优选的为：对获得的超分辨图像，利用imagej、imaris、origin和prism 8软件提取获得的参数信息，根据目标分子的大小建立模拟斑点和量化分析，进一步展示活细胞核内目标分子的特异性结构特点和分布特征信息。在本发明中，利用imagej和imaris对目标分子进行荧光强度的模拟时，需要屏蔽掉背景信号，选择目标区域进行分析，运用origin和prism8软件进行量化分析时，需要注意单分子结构和分布的特异性信息。
35.本发明提供的上述方法能够同时适用于多种植物，优选的包括拟南芥、烟草和杨树等植物。
36.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
38.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
39.实施例1
40.一种观察植物活细胞核蛋白的方法：
41.1)halo-tag转基因植株的获取：以ph6htnt7载体为模板，通过pcr技术、双酶切、同源重组方法，将halo-tag序列连接到带有目的基因的真核表达载体pcambia1300中，最终产物经过大肠杆菌的转化和扩增，将测序正确的菌株(即含有halotag序列的菌株)保存起来。具体步骤如下：
42.在tair(https://www.arabidopsis.org)上查到全基因组序列，运用primer premier5软件对基因序列分析设计特异性引物，f：ggaggaggtactacattgtctagagtcgacatggcagaaatcggtact(seq id no.1)；r：taccgatgatacgaacgaaagctctgcagttagccggaaatctcgagcgt(seq id no.2)，并以ph6htnt7载体为模板进行pcr扩增；pcr扩增体系是20微升；rcr扩增酶premix taq
tm
(rr902q)，购买自takara公司。在已连接有基因med18的pcambia1300载体上的多克隆位点中选择两个酶切位点进行双酶切(xbai和psti)反应，购买自使用takara公司。根据同位克隆连接体系要求，计算反应体系中各组分的体积。加样于pcr管中，混匀并离心至管底，置于pcr仪中50℃连接30min，得到重组质粒pcambia1300-med18-halotag。上述步骤中的连接步骤使用的试剂盒为同源重组酶easygeno快速重组试剂盒(vi201)，购买自北京天根生化科技有限公司。
43.将上述构建成功的载体转化农杆菌后，利用gv3101农杆菌菌株在蔗糖-silwetl-77(50毫升体系中加入10微升)混合液的介导下，对正在抽薹开花的野生型拟南芥进行侵染，收获的成熟种子，经过潮霉素1/2ms固体培养板(称取1.1075g ms(murashige and skoog basal salts)盐((sigma-aldrich)与5g蔗糖溶解于500ml ddh2o中，ph值调至5.9左右后，加入5g琼脂1.034
×
105pa高压120℃灭菌20min。待培养基降温到室温后，500毫升体系中加入80微升hygromycin(50mg/ml))上筛选出的阳性苗，即为t1代转基因植株。
44.上述载体转化农杆菌的具体方法为：农杆菌化学转化采用gv3101感受态细胞
(ac1001)，购买自上海唯地生物技术有限公司；每50μl农杆菌感受态细胞加入300ng的质粒dna，混匀，随后静置于冰上约30min，液氮中速冻5min，37℃的水浴锅中5min；加入700μl不含抗生素的yeb液体，到28℃摇床中，180rpm，培养3～5h；菌体沉淀，并留取100μl左右上清，重悬菌体，并将菌液涂布于含有抗生素的lb平板上，放置于28℃培养箱中，倒置培养72h之后观察。
45.2)原生质体细胞的制备和培养：取培养条件为23℃、16h光照/8h黑暗下，生长约3周未抽薹的转基因拟南芥叶片为材料，用吉利双面刀片去除叶柄和叶端部，切成宽度约为0.1mm的细条状，放入10ml含有纤维素酶和离析酶的混合酶解液(纤维素酶0.15g和离析酶0.03g)中，在室温下、避光条件下，脱色摇床(orbital shaker ts-1)中孵育3h左右，进行原生质体的酶解和提取；经过镜检酶解完成的原生质体，通过两次w5 solution洗涤和重悬原生质体，来彻底去除没有溶解完全的叶片残渣和破碎的原生质体，离心过程采用德国进口eppendorf公司的冷冻离心机，其中100g离心2min，升降速为3；通过两次清洗和重悬后，获得活性良好的细胞，后续原生质体在28℃避光的培养箱(上海恒科公司的恒温培养箱)中进行培养。
46.3)halo-tag荧光染料的孵育和漂洗：用promega公司的halo-tag tmr荧光染料，所有使用过的w5 solution均在28℃恒温培养箱中进行预热；首先配置预温的halo-tag配基稀释液(1μl halo-tag tmr配基+200μl w5 solution)，然后在800μl原生质体溶液中加入200μl稀释后的halo-tag tmr配基，轻轻混匀，最后放入28℃避光的培养箱孵育15min。吸出1ml的halo-tag配基稀释液、加入2ml预热的w5，在脱色摇床中重复清洗三次，每次5min，再换成1ml预热的w5，轻轻混匀，28℃并避光条件下培养30min，来彻底清洗未结合的配基。
47.4)3d-sim超分辨成像观察：细胞核的dapi染色：采用索莱宝的10ug/ml的即用型dapi荧光染料的工作液，对上述标记后的原生质体进行室温避光10min的染色，洗涤后吸取10μl溶液放于圆形的载玻片和适配器上,沉降5分钟后进行成像观察；利用deltavision omx结构照明的超高分辨率显微成像系统的3d模式进行观察；镜油选择折射率为1.518，并采用405nm和568nm两种激光激发样品，曝光时间均为50ms，激光强度均为5％；利用3d-sim模式，设置0.125μm的间隔，共拍摄1μm厚度，对标记后完整的原生质体进行超分辨成像拍摄；最后将所有原始图像进行超分辨算法的重构和处理，将拍摄好的图像，首先第一步进行omx si reconstruction处理，并勾选skip k0 angle refinement search和discard negative intensities选项，第二步omx align image处理，并勾选align image选项，第三步进行deconvolution处理，并设置number of cycles为8，最终获得处理后的超分辨图像。结果如图2和图3所示。
48.5)利用软件分析图像和计算参数：首先，利用image j软件的analyze的plot profile选项，对细胞核任意划线区域的荧光点，进行荧光强度分布的分析；同时利用imagej软件的plugins的interactive3d的surface plot选项，得到整个细胞核的3d伪彩荧光强度分布图；其次，利用imaris软件对超分辨图像进行surfaces分析，设置surfaces detail为0.159μm，通过调整threshold值，来最终确定新建立的surfaces模拟区域覆盖住目标分子，结果如图4所示，导出含有全部参数用于后续分析；利用imaris软件的animation功能，得到3d的gif立体图像；最后，利用origin软件进行相关参数的拟合分析，得到最终的统计图，并利用prism 8软件对荧光强度的分布进行折线图展示，结果如图5所示，最终命名
和保存图像。
49.图6和7为相同材料用mcherry标记的超分辨共聚焦airyscan成像下的效果(具体方法参见文献split-halotag imaging assay for sophisticated microscopy of protein
–
protein interactions in planta)，显然分辨率不够，看不清楚细胞核内的单个分子。而且mcherry荧光蛋白亮度不够，导致成像对比度不好，并且特别容易猝灭，不能长时间成像和再次成像。与本发明利用halo-tag标记和3d超分辨成像的效果相差很多。
50.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。