一种PINP单克隆抗体、含有其的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及化学发光免疫诊断，特别是涉及一种pinp（ⅰ型前胶原氨基端原肽）单克隆抗体、含有其的试剂盒及其在检测人血清pinp中的应用。

背景技术：

1、骨骼ⅰ型胶原约占骨质的 90%，是人体最丰富的胶原蛋白形式。i 型胶原主要在骨组织中合成，首先是原胶原形式，此时在 i 型原胶原的氨基 n 端和 c 端各有一个延长肽，分别被称为 i 型原胶原 n 端前肽（pinp）和 i 型原胶原 c 端前肽（picp）；当 i 型原胶原被成骨细胞分泌到细胞外时，n 端和 c 端的延长肽会被蛋白酶切割，少量沉积在骨基质中，而大部分则会进入血液循环，最终被肝脏代谢清除。血液中的pinp为三聚体形式(由三聚体胶原转化而来)，但在热降解作用下会很快成为单体形式。pinp试剂检测的是血液中所有的pinp形式，因此称为总pinp（tpinp）。

2、在排除肝脏疾病的影响下，检测血液中的pinp 含量能够确切的反应成骨细胞的活性，进而反应体内骨代谢的强度，指导骨代谢异常引起疾病的诊断和治疗。此外，pinp也可用于佩吉特骨病(paget’s bone disease)、成骨细胞转移瘤、乳腺癌，前列腺癌和儿童青少年的生长过程监测。pinp检测目前分为全段pinp(intact)和总pinp(intact+monomer)两种，除了在检测肾功能障碍病人时，全段pinp的结果更加准确外，其他情况下两者的相关性还是较好的。

3、i型前胶原氨基末端肽检测方法多采用免疫学方法。目前我国批准上市的i型前胶原氨基末端肽检测试剂多为进口，采用的检测方法学多为酶免检测法和化学发光检测法。酶免检测法在检测灵敏度、检测线性范围等方面远不及化学发光检测法。此外化学发光检测法还具有底物危害小、有效期长、干扰因素少、自动化程度高等优势。但无论是酶免还是化学发光检测法，它们都建立在抗原与抗体特异性结合的基础上，因此特异性的抗体对是这些检测方法的核心原料。

4、然而，目前市面上的抗体原料存在各种不足，很难找到合适的抗体配对。多肽作为免疫原制备的单克隆抗体虽然特异性较好，但由于抗原位点单一，无法满足不同方法学的需求。同时，多肽序列与天然蛋白结构的相似度有一定的差异，因此所获得单克隆抗体与天然蛋白的结合力也会较差，进而会影响检测试剂的灵敏度。此外，多克隆抗体的批间差控制也是目前在开发体外诊断试剂中的一大难题。

技术实现思路

1、本技术针对现有技术的上述不足，提供一种能有效提高pinp的检测效率和灵敏度，批间差容易控制的pinp单克隆抗体。

2、为了解决上述技术问题，本技术采用的技术方案为：一种pinp单克隆抗体，该抗体通过如下方法制备获得，制备过程包括：先通过合成基因并构建载体后在大肠杆菌中诱导表达pinp蛋白p1、p2和p3并进行纯化，获得重组抗原p1、p2和p3；将重组抗原p2和p3对动物进行免疫，获得免疫细胞；将所述免疫细胞和融合伴侣细胞融合，并且挑选出阳性融合细胞；对所述阳性融合细胞进行亚克隆得到克隆化的融合细胞，所述克隆化的融合细胞分泌单克隆抗体；其中，所述抗原为重组抗原p1、p2和p3，所述重组抗原p1、p2和p3分别对应pinp序列中23-161aa、23-96aa和97-161aa基因序列；所述单克隆抗体为p1、p2和p3来源的单抗。

3、进一步地，所述的p1、p2和p3对应的氨基酸序列如下：

4、p1:qeegqvegqdedippitcvqnglryhdrdvwkpepcricvcdngkvlcddvicdetkncpgaevpegeccpvcpdgsesptdqettgvegpkgdtgprgprgpagppgrdgipgqpglpgppgppgppgppglggnfap；

5、p2:qeegqvegqdedippitcvqnglryhdrdvwkpepcricvcdngkvlcddvicdetkncpgaevpegeccpvcp

6、p3:dgsesptdqettgvegpkgdtgprgprgpagppgrdgipgqpglpgppgppgppgppglggnfap。

7、进一步地，所述重组抗原的制备包括：将所述23-161aa、23-96aa和97-161aa基因序列均分别采用bamh1、xho1双酶切；将双酶切后的23-161aa、23-96aa和97-161aa基因序列分别与采用相同酶切方式酶切的pet28a质粒连接，并转化至大肠杆菌感受态细胞，表达纯化得到所述重组抗原p1、p2和p3。

8、进一步地，所述阳性融合细胞通过间接elisa法挑选得到。

9、进一步地，所述的抗体的制备方法还包括以下步骤：在捕获抗体中加入重组抗原p1，进行免疫反应，清洗后加入标记抗体，清洗后加入sa-hrp（辣根过氧化物酶标记streptavidin也称辣根过氧化物酶标记链霉亲和素），显色则配对成功。

10、本技术还提供一种tpinp体外诊断试剂盒，所述的试剂盒包括发光试剂、固相试剂、校准品和质控品。

11、进一步地，所述固相试剂的制备原料包括磁微粒，所述的磁微粒为fe2o3或fe3o4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。

12、进一步地，所述的固相试剂为pinp单克隆抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒的浓度为0.1~1mg/ml，固相试剂中还包含游离的pinp单克隆抗体、其浓度为50~1000ng/ml。

13、进一步地，所述发光试剂为含吖啶酯按比例标记的pinp单克隆抗体的工作液，浓度为0.1~1.0μg/ml。

14、本发明还提供了一种tpinp体外诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

15、制备固相试剂稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节ph至6.0~8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；

16、制备发光试剂稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节ph至5.0~7.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；

17、制备校准品稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节ph至6.0~8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；

18、制备校准品：将pinp重组抗原按照比例添加到校准品稀释液中，配制成浓度分别为100ng/ml、800ng/ml的校准品溶液，分别记为cal1、cal2；

19、制备质控品：将pinp抗原重组抗原按照比例添加到校准品稀释液中，配制成浓度分别为60ng/ml、150ng/ml的质控品溶液，分别记为qc1、qc2；

20、制备固相试剂：将pinp抗体包被在磁微粒表面制备成中间品，再取适量的磁微粒中间品加入到固相试剂稀释液中，配制成工作浓度为0.1~0.8mg/ml的混悬液；

21、制备发光试剂：将吖啶酯按比例标记pinp抗体上，制备成发光试剂中间品，再取适量的发光试剂中间品加入到发光试剂稀释液中，配制成工作浓度为0.1~1.0μg/ml的发光试剂工作液。

22、进一步地，所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3- (n-吗啉基）丙磺酸缓冲液、2-(n-吗啉）乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种，所述缓冲液的浓度为0.05-0.2mol/l，ph值为6~9。

23、进一步地，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种，所述无机盐的浓度为50~500mm/l。

24、进一步地，所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、羟乙基乙二胺三乙酸和聚丙烯酸中的一种或多种，所述金属螯合剂的浓度为0.1~1%（质量百分比）。

25、进一步地，所述蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、牛igg、鱼皮明胶中的一种或多种，所述蛋白保护剂的浓度为0.1~1%（质量百分比）。

26、进一步地，所述防腐剂选自叠氮化钠、n- 甲基－异噻唑酮、n'- 亚甲基-双[n'-(3-羟甲基-2,5 -二酮-4-咪唑烷基)]脲或proclin 300 中的一种或多种，所述防腐剂的浓度为0.1%-0.5%（质量百分比）。

27、进一步地，所述表面活性剂选自吐温20、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物或聚乙二醇辛基苯基醚，所述表面活性剂的浓度为1%-10%（质量百分比）。

28、本技术上述的缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂的浓度为其各自所在的配置后的试剂中的终浓度。

29、进一步地，所述包被有pinp抗体的磁微粒为选择不同粒径和表面活性功能基团的磁微粒与pinp抗体形成的复合物，所述磁微粒表面的活性功能基团选自对甲苯磺酰基或羧基，所述的磁微粒的粒径为0.1-5μm。

30、本发明提供了一种人血清pinp的检测方法，使用上述的tpinp体外诊断试剂盒，测定仪器为ms-i3080或其他系列全自动化学发光仪，所述pinp检测方法包括以下步骤：反应管中加入样本孵育、固相试剂和发光试剂，37℃孵育15分钟后，清洗后测量发光值rlu； 以校准品浓度为横坐标，各浓度校准品对应的发光值rlu为纵坐标，作logit-log(5p)函数曲线；校准成功后，测定仪器自动计算相对应的浓度值。

31、本技术的优点和有益效果：

32、1.将本技术获得的单克隆抗体用于磁微粒化学发光免疫诊断试剂，其中固相试剂中的pinp抗体作为抓捕抗体，发光试剂中的pinp抗体作为检测抗体，利用经典的双抗体夹心法捕获血清中的待测物，灵敏度高、特异性强、检测范围宽且检测效率高。

33、2.本技术制备的是一种pinp单克隆抗体，可有效控制批间差，有利于满足诊断试剂的批量生产及临床诊断需求。

34、3.本发明试剂盒在固相组分中添加了游离的pinp单克隆抗体，可中和掉部分待测物，实现样本无需稀释，加快测试速度，提高测试结果的准确性的优点； 而如果在不添加游离抗体的情况下，不稀释样本直接检测，会有hook效应导致高值样本测不准。

35、4.本发明试剂盒可以适配于ms-i3080（美康盛德生产）及其他系列全自动化学发光仪，实现进样、加试剂、清洗、检测、计算等一系列流程的全自动化，提高检测效率。