一种同时测定呋喃妥因中多种杂质的检测方法与流程

1.本发明涉及药物检测技术领域，更具体而言，涉及一种同时测定呋喃妥因中多种杂质的检测方法。


背景技术：

2.呋喃妥因于1953年在美国上市，在20世纪70～80年代被广泛地应用，是一个经典的治疗尿路感染的药物。在60多年的应用历史中未发生耐药性问题，可以有效地治疗急性下尿路感染、慢性尿路感染和预防导管相关的感染，可以作为预防经尿道前列腺电切术感染的基础药物，并阻止再感染。其作用主要归功于其在尿液中的高浓度和血浆的低浓度，有效的覆盖革兰氏阳性和阴性细菌，且很少有耐药菌株的产生，而优于其他的新药。
3.呋喃西林是呋喃妥因合成副产物，毒性较大，中国药典2020年版与美国药典usp-nf 2021呋喃妥因的质量标准中，均采用hplc法对呋喃西林进行控制，限度均为0.01％。
4.5-硝基糠醛二乙酯为合成呋喃妥因的起始物料，在最后一步缩合反应中带入，应在呋喃妥因中进行控制，目前，各国药典中仅美国药典usp-nf 2021采用薄层色谱法控制，但方法灵敏度较低，限度为不得过1.0％。
5.糠醛为起始物料(5-硝基糠醛二乙酯)合成所用物料。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单，糠醛在3类致癌物清单中。根据cpdb数据库，糠醛的td
50
为683mg/kg/天(大鼠)和197mg/kg/天(小鼠)，采用较低的小鼠值计算人类可接受摄入量为197μg/天，呋喃妥因的日最大剂量为400mg，从而计算该杂质在呋喃妥因中控制限度应为0.05％，而各国药典中均未对糠醛进行控制。
6.对于呋喃妥因中可能存在其他有关物质，美国药典中未进行控制，中国药典、欧洲药典、英国药典中均仅采用薄层色谱法控制，方法灵敏度低，无法满足ichq3a控制要求。ich q3a要求对于每日最大剂量小于等于2g的原料药，规定杂质的鉴定限度为0.10％或每天摄入1.0mg(取限度低者)，呋喃妥因每日最大服用量小于2g，未知单杂控制限度应在0.10％以下。
7.现有技术中仅有对呋喃妥因中杂质呋喃西林和糠醛的检测，且需要在不同的色谱条件下分别检测，检测成本高、耗时长且灵敏度不高给制药企业带来成本上的问题，不利于推广和使用。


技术实现要素：

8.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种同时测定呋喃妥因中多种杂质的检测方法，所述多种杂质为呋喃西林、糠醛、5-硝基糠醛二乙酯、杂质d、杂质j和杂质k；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相由流动相a和流动相b组成，采用梯度洗脱。所述杂质化学结构式如下所示：
[0009][0010][0011]
本发明发现，采用高效液相色谱法对呋喃妥因中呋喃西林、5-硝基糠醛二乙酯、糠醛及其他有关物质进行检测时，流动相的选择对杂质分离有较大影响，当采用固定比例的流动相a和流动相b进行检测时，难以将杂质很好的分离；经过大量尝试发现，当采用上述洗脱方式，可将呋喃妥因与呋喃西林、5-硝基糠醛二乙酯、糠醛及其他各杂质有效分离，同时缩短运行时间。
[0012]
优选的，所述检测方法的具体操作步骤为：
[0013]
s1.供试品溶液：取呋喃妥因，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成供试品溶液；
[0014]
s2.对照溶液：精密量取供试品溶液，用溶剂定量稀释制成呋喃妥因对照溶液；
[0015]
s3混合溶液：取呋喃妥因对照品，加溶剂溶解，精密加入呋喃西林对照品、糠醛对照品、5-硝基糠醛二乙酯对照品、杂质d对照品、杂质j对照品、杂质k对照品，定量稀释制成混合溶液；
[0016]
s4.各杂质定位溶液：取呋喃西林对照品，精密称定，加溶剂溶解制成呋喃西林定位溶液；取糠醛对照品，精密称定，加溶剂溶解制成糠醛定位溶液；取5-硝基糠醛二乙酯对照品，精密称定，加溶剂溶解制成5-硝基糠醛二乙酯定位溶液；取杂质d对照品，精密称定，加溶剂溶解制成杂质d定位溶液；取杂质j对照品，精密称定，加溶剂溶解制成杂质j定位溶液；取杂质k对照品，精密称定，加溶剂溶解制成杂质k定位溶液；
[0017]
s5.调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a，流动相b，调节柱温，调节流动相流速，调节检测波长，采用梯度洗脱；
[0018]
s6.测定：精密量取s2～s4制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0019]
优选的，所述s1中供试品溶液的浓度为0.8～1.2mg/ml。
[0020]
优选的，所述s2中对照溶液的浓度为0.08～0.12μg/ml。
[0021]
优选的，所述s3中混合溶液呋喃妥因对照品的浓度为0.8～1.2mg/ml，呋喃西林对照品的浓度为0.08～0.12μg/ml，糠醛对照品浓度为0.4～0.6μg/ml，5-硝基糠醛二乙酯对照品、杂质d对照品、杂质j对照品和杂质k对照品的浓度均为0.8～1.2μg/ml。
[0022]
优选的，所述s4中各杂质定位溶液呋喃西林定位溶液浓度为0.08～0.12μg/ml；糠醛定位溶液浓度为0.4～0.6μg/ml；5-硝基糠醛二乙酯定位溶液浓度为0.8～1.2μg/ml；杂质d定位溶液浓度为0.8～1.2μg/ml；杂质j定位溶液浓度为0.8～1.2μg/ml；杂质k定位溶液浓度为0.8～1.2μg/ml。
[0023]
优选的，所述溶剂为50％乙腈。
[0024]
优选的，所述s5中色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，规格为inertsil ods-3，250mm
×
4.6mm，5μm。
[0025]
优选的，所述的流动相a为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液浓度为0.05mol/l，用氢氧化钠溶液调节ph值至7.1
±
0.1，所述流动相b为100％乙腈；调节柱温为25～35℃，调节流动相流速为0.9～1.1ml/min，调节检测波长分别为375nm检测呋喃妥因、杂质呋喃西林、杂质d和杂质k，304nm检测5-硝基糠醛二乙酯、糠醛和杂质j。磷酸盐缓冲液的ph值对呋喃妥因与呋喃西林的分离度有较大影响，当磷酸盐缓冲液的ph值为7.1
±
0.1时，分离效果更好；不仅能使呋喃妥因与呋喃西林的分离度达到4.0以上，还能使其他杂质均达到有效分离。因呋喃妥因中各杂质紫外吸收波长相差较大，难以在同一波长下对所有杂质同时进行检测，本发明用波长375nm和304nm可对6种杂质进行检测。
[0026]
优选的，所述采用梯度洗脱，流动相的总体积为100％计，
[0027]
在第0～4min，所述的流动相a的体积为98％，所述的流动相b的体积为2％；
[0028]
在第4～30min，所述的流动相a的体积由100％递减为80％，所述的流动相b的体积由2％递增为20％；
[0029]
在第30～60min，所述的流动相a的体积由80％递减为45％，所述的流动相b的体积由20％递增为55％；
[0030]
在第60～65min，所述的流动相a的体积为45％，所述的流动相b的体积为55％；
[0031]
在第65～66min，所述的流动相a的体积由45％递增为98％，所述的流动相b的体积由55％递减为2％；
[0032]
在第66～75min，所述的流动相a的体积为98％，所述的流动相b的体积为2％。
[0033]
本发明所具有的有益效果如下：
[0034]
本发明根据产品结构特点及化合物性质，提供了一种采用高效液相色谱仪即可同时测定呋喃妥因中多种杂质的检测方法。采用梯度洗脱色谱条件，进一步能同时测定上述6种杂质并分离，各杂质与呋喃妥因均可有效分离，通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏度和准确度进一步得到提升，并满足各杂质的限度要求，检测成本和操作难度大大降低。
[0035]
本发明方法采用设备简单、分析速度快、专属性好、检测成本低、准确度高，能够快速、简便、准确地控制杂质的量，降低药物安全风险。本发明方法专属性强、重现性高，便于对呋喃妥因的质量检测与杂质监控，有利于呋喃妥因杂质检测方法普及，有利于呋喃妥因的安全推广与应用。
[0036]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解
到。
附图说明
[0037]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0038]
图1是本发明实施例一中375nm波长下混合溶液的色谱图；
[0039]
图2是本发明实施例一中304nm波长下混合溶液的色谱图。
具体实施方式
[0040]
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0041]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
[0042]
本实施例提供一种采用高效液相色谱仪同时测定呋喃妥因中多种杂质的检测方法，采用以下条件进行测定：
[0043]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的规格为inertsil ods-3，250mm
×
4.6mm，5μm；流动相a：磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液浓度为0.05mol/l，用氢氧化钠溶液调节ph值至7.1
±
0.1)；流动相b：100％乙腈；流速：0.9～1.1ml/min；柱温：25～35℃；检测波长：375nm，304nm；采用梯度洗脱，流动相的总体积为100％计。
[0044]
在第0～4min，所述的流动相a的体积为98％，所述的流动相b的体积为2％；
[0045]
在第4～30min，所述的流动相a的体积由100％递减为80％，所述的流动相b的体积由2％递增为20％；
[0046]
在第30～60min，所述的流动相a的体积由80％递减为45％，所述的流动相b的体积由20％递增为55％；
[0047]
在第60～65min，所述的流动相a的体积为45％，所述的流动相b的体积为55％；
[0048]
在第65～66min，所述的流动相a的体积由45％递增为98％，所述的流动相b的体积由55％递减为2％；
[0049]
在第66～75min，所述的流动相a的体积为98％，所述的流动相b的体积为2％。
[0050]
供试品溶液：取呋喃妥因，精密称定，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解并用水定量稀释制成1mg/ml供试品溶液。
[0051]
对照溶液：精密量取供试品溶液，用溶剂(50％乙腈溶液)定量稀释制成1μg/ml呋喃妥因对照溶液。
[0052]
混合溶液：取呋喃妥因对照品，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解，精密加入呋喃西林对照品、糠醛对照品、5-硝基糠醛二乙酯对照品、杂质d对照品、杂质j对照品、杂质k对照品，定量稀释制成混合溶液；其中，呋喃妥因对照品的浓度为1mg/ml，呋喃西林对照品的浓度为0.1μg/ml，糠醛对照品的浓度为0.5μg/ml，5-硝基糠醛二乙酯对照品、杂质d对照品、杂质j对照品、杂质k对照品的浓度分别为1μg/ml。
[0053]
各杂质定位溶液：取呋喃西林对照品，精密称定，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解制成呋喃西林定位溶液浓度为0.1μg/ml；
[0054]
取糠醛对照品，精密称定，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解制成糠醛定位溶液浓度为0.5μg/mll；
[0055]
取5-硝基糠醛二乙酯对照品，精密称定，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解制成5-硝基糠醛二乙酯定位溶液浓度为1μg/ml；
[0056]
取杂质d对照品，精密称定，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解制成杂质d定位溶液浓度为1μg/ml；
[0057]
取杂质j对照品，精密称定，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解制成杂质j定位溶液浓度为1μg/ml；
[0058]
取杂质k对照品，精密称定，加溶剂(50％乙腈溶液)溶解制成杂质k定位溶液浓度为1μg/ml。
[0059]
各溶液的具体配置过程及本发明方法的实验验证过程及结果见实验例一至四。
[0060]
实施例一
[0061]
专属性试验
[0062]
供试品溶液的制备：取呋喃妥因约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加50％乙腈10ml使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0063]
对照溶液的制备：精密量取供试品溶液适量，用溶剂定量稀释制成每1ml中含1μg呋喃妥因的溶液，作为对照溶液。
[0064]
混合溶液的制备：取呋喃妥因对照品约20mg，加乙腈10ml使溶解，精密加入呋喃西林对照品，糠醛对照品、5-硝基糠醛二乙酯对照品、杂质d对照品、杂质j对照品、杂质k对照品各适量，加水稀释制成每1ml中含呋喃妥因对照品1mg，呋喃西林对照品0.1μg，糠醛对照品0.5μg，5-硝基糠醛二乙酯对照品、杂质d对照品、杂质j对照品、杂质k对照品各1μg的溶液，作为混合溶液。
[0065]
各杂质定位溶液的配制：取呋喃西林对照品适量，精密称定，加50％乙腈溶解并稀释得到0.1μg/ml的溶液，作为呋喃西林定位溶液；取糠醛对照品适量，精密称定，加50％乙腈溶解并稀释得到0.5μg/ml的溶液，作为糠醛定位溶液；取5-硝基糠醛二乙酯对照品适量，精密称定，加50％乙腈溶解并稀释得到1μg/ml的溶液，作为5-硝基糠醛二乙酯定位溶液；取杂质d对照品、杂质j对照品、杂质k对照品各适量，精密称定，分加50％乙腈溶解并稀释得到1μg/ml的溶液，分别作为杂质d、杂质j、杂质k定位溶液。
[0066]
测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，流动相a为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml溶解，用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至7.1
±
0.1)，流动相b为50％乙腈，柱温为30℃，流速为每分钟1ml，检测波长为375nm、304nm，采用梯度洗脱。
[0067]
精密量取上述制备对照溶液、混合溶液及各杂质定位溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果如表1所示，混合溶液色谱图如图1和图2所示。
[0068]
表1.专属性-定位试验结果
[0069][0070]
结论：溶剂不干扰供试品溶液中各已知杂质测定，各杂质之间，杂质与主峰之间均分离良好，理论塔板数均满足有关物质测定的要求。
[0071]
实施例二
[0072]
线性与范围试验
[0073]
线性溶液的制备：取呋喃妥因对照品、呋喃西林对照品、5-硝基糠醛二乙酯对照品、杂质d对照品、糠醛对照品、杂质j对照品、杂质k对照品各适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml分别含200μg的溶液，作为各贮备溶液，精密量取适量，用溶剂(50％乙腈溶液)稀释制成系列线性溶液。
[0074]
精密量取上述各溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；结果如表2所示。
[0075]
表2.线性与范围试验结果
[0076]
[0077][0078]
结论：(1)呋喃妥因在0.032～2.107μg/ml(相当于检测浓度的0.003％～0.20％)浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝46625.0590x+366.5408，r＝0.9998，y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比为0.7％。
[0079]
(2)呋喃西林：在在0.020～0.196μg/ml(相当于检测浓度的0.002％～0.020％)浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝51453.0467x+16.0732，r＝0.9997，y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比为0.3％。
[0080]
(3)杂质d：在0.029～1.960μg/ml(相当于检测浓度的0.003％～0.20％)浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝38339.0547x+345.4003，r＝0.9998，y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比为0.9％。
[0081]
(4)杂质k：在0.030～2.025μg/ml(相当于检测浓度的0.003％～0.2％)浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝38034.2562x+163.6797，r＝0.9998，y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比为0.4％。
[0082]
(5)5-硝基糠醛二乙酯：在0.050～1.997μg/ml(相当于检测浓度的0.005％～0.20％)浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝29072.9433x+94.8157，r＝1.0000，y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比为0.3％。
[0083]
(5)糠醛：在0.099～0.990μg/ml(相当于检测浓度的0.01％～0.1％)浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝10382.3386x+48.6341，r＝0.9997，y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比为0.9％。
[0084]
(7)杂质j：在0.021～2.061μg/ml(相当于检测浓度的0.002％～0.2％)浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝74858.6593x+508.6866，r＝0.9998，y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比为0.6％。
[0085]
实施例三
[0086]
回收率试验
[0087]
杂质对照品：取呋喃西林、5-硝基糠醛二乙酯、杂质d、糠醛、杂质j、杂质k对照品各适量，精密称定，用乙腈溶解并用溶剂(50％乙腈溶液)定量稀释制成每1ml中含呋喃西林1μ
g/ml，糠醛5μg/ml，其他杂质各10μg/ml的溶液，作为杂质对照品储备液。精密量取对照品储备液2ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制2份。
[0088]
准确度溶液的配制：
[0089]
50％准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈约10ml使溶解，加入杂质对照品储备液1ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制3份。
[0090]
100％准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈约10ml使溶解，加入杂质对照品储备液2ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制6份。
[0091]
150％准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈约10ml使溶解，加入杂质对照品储备液3ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制3份。
[0092]
本底溶液的配制：
[0093]
取供试品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈约10ml使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0094]
精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，结果如表3～8所示。
[0095]
表3.有关物质方法验证-呋喃西林回收率结果
[0096][0097]
表4.有关物质方法验证-杂质d回收率结果
[0098]
[0099][0100]
表5.有关物质方法验证-杂质k回收率结果
[0101][0102]
表6.有关物质方法验证-5-硝基糠醛二乙酯回收率结果
[0103]
[0104][0105]
表7.有关物质方法验证-糠醛回收率结果
[0106][0107]
表8.有关物质方法验证-杂质j回收率结果
[0108]
[0109][0110]
结论：杂质回收率试验结果显示，呋喃西林、杂质d、杂质k、5-硝基糠醛二乙酯、糠醛、杂质j的12份准确度样品的回收率均在80％～120％之间，平均回收率分别为104.54％、104.14％、101.36％、100.14％、105.32％、101.51％，由表3～9可知，各杂质回收率满足本品对各已知杂质的测定要求，表明本方法准确度良好。
[0111]
实施例四
[0112]
耐用性试验
[0113]
取实验例一中的混合溶液，分别于柱温25℃、35℃；流速0.9ml/min、1.1ml/min；流动相ph7.0、ph7.2条件下进行试验，结果见表9～10。
[0114]
表9.耐用性试验结果(375nm混合溶液-分离度)
[0115][0116]
表10.耐用性试验结果(304nm混合溶液-分离度)
[0117][0118][0119]
结论：微调色谱条件下，混合溶液中杂质间、杂质与主峰间分离度均符合要求。表明本方法耐用性良好。
[0120]
以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。