一种测定食品中低聚半乳糖含量的方法与流程

本发明涉及一种测定食品中低聚半乳糖含量的方法，属于食品检测。

背景技术：

1、低聚半乳糖(galactooligosaccharides，gos)一般是由葡萄糖或者半乳糖与1～6个半乳糖基链连得到的低聚糖。低聚半乳糖是由2～7个聚合度组成的混合物。经芽孢杆菌atcc 31382(bacillus sp.)或米曲霉(aspergillus oryzae)生产的β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键，将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，同时通过转移半乳糖苷的作用，将水解下来的半乳糖苷转移到乳糖分子，生成食品营养强化剂低聚半乳糖。并且相同聚合度的异构体种类众多，因此定性定量的难度极大。

2、低聚半乳糖由于其独特的益生作用，现被食品保健品行业广泛的应用。在市场中，存在低聚半乳糖乳制品，主要原理是利用转糖基β-半乳糖苷酶，将乳中含有的大量乳糖合成为低聚半乳糖。

3、目前，低聚半乳糖的检测方法主要有通过酶解低聚半乳糖为半乳糖的离子色谱法，利用原料做对照品的离子色谱指纹图谱测定法、高效液相色谱双柱法、气相色谱法、半制备液相色谱-离子色谱以及高效液相色谱-质谱法。但离子色谱法重复性较差，对乳糖含量较高的样品测定不准确；离子色谱指纹图谱法必须要用到相应的原料做对照品，并且需要确定原料准确的gos含量；高效液相双柱法检测限较高，只适合测定原料；气相色谱法、半制备液相色谱-离子色谱以及高效液相色谱-质谱法前处理相对复杂，或仪器普及率不高，不能很好地测定食品中的低聚半乳糖含量。此外，目前尚且缺乏能够测定食品中各聚合度的低聚半乳糖的含量的方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种测定食品中低聚半乳糖含量的方法。本发明的方法能够准确测定食品中的低聚半乳糖含量，并能够得到其各聚合度的含量。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种测定食品中低聚半乳糖含量的方法，其包括以下步骤：

3、将样品于水中溶解后，取适量的上清液进行酶解、灭酶、衍生，得到衍生液；

4、对衍生液进行液相色谱检测；

5、基于液相色谱检测结果，采用混合有乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的标准标尺工作液和昆布三糖标准系列工作液对样品进行定性分析和定量分析，得到样品中低聚半乳糖的总含量以及不同聚合度的低聚半乳糖的含量。

6、在上述的方法中，优选地，所述酶解采用淀粉葡萄糖苷酶进行。

7、在上述的方法中，优选地，所述酶解是将上清液与磷酸盐缓冲溶液、淀粉葡萄糖苷酶溶液混合进行酶解。

8、在上述的方法中，优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.19～0.21mol/l(以溶液中磷酸盐的总摩尔量计)，ph值为5.5～6.5。更优选地，所述磷酸盐缓冲溶液是通过以下步骤配制的：将质量比为2.2:0.6的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾三水合物溶解于水中并稀释后，得到所述的磷酸盐缓冲溶液。

9、在上述的方法中，优选地，所述淀粉葡萄糖苷酶溶液的酶活力为150～180u/ml。更优选地，所述淀粉葡萄糖苷酶溶液是通过以下步骤配制的：将淀粉葡萄糖苷酶溶解于乙酸铵溶液中，得到所述的淀粉葡萄糖苷酶溶液。尤为优选地，所述乙酸铵溶液的浓度为0.19～0.21mol/l，ph值为4.4-4.6。

10、在上述的方法中，优选地，所述上清液、磷酸盐缓冲溶液和淀粉葡萄糖苷酶溶液的体积比为500:50:200；

11、在上述的方法中，优选地，所述酶解的温度为50～65℃，时间为60～120min；更优选地，所述酶解的温度为50～60℃，时间为60min；尤为优选地，所述酶解的温度为60℃。

12、在上述的方法中，优选地，所述灭酶的温度为90～100℃，时间为5～6min。

13、在上述的方法中，优选地，所述衍生采用2-氨基苯甲酰胺进行。

14、在上述的方法中，优选地，所述衍生是将灭酶后的混合物与2-氨基苯甲酰胺溶液混合进行。

15、在上述的方法中，优选地，所述2-氨基苯甲酰胺溶液为浓度为0.34～0.36mol/l的2-氨基苯甲酰胺和浓度为0.9～1.1mol/l的氰基硼氢化钠的乙酸-二甲基亚砜混合溶液；更优选地，乙酸与二甲基亚砜的体积比为3:7。更具体地，所述2-氨基苯甲酰胺溶液可以是通过以下步骤配制的：将质量比为476：630的2-氨基苯甲酰胺和氰基硼氢化钠用乙酸-二甲基亚砜溶液溶解并混合均匀，得到所述的2-氨基苯甲酰胺溶液；其中，2-氨基苯甲酰胺和氰基硼氢化钠的总量与乙酸-二甲基亚砜溶液的用量比为1106mg：10ml。

16、在上述的方法中，优选地，所述灭酶后的混合物与所述2-氨基苯甲酰胺溶液的体积比为20:200。

17、在上述的方法中，优选地，所述衍生的温度为55～65℃(更优选为60℃)，时间为60～120min。

18、根据本发明的具体实施方式，优选地，上述测定食品中低聚半乳糖含量的方法具体包括以下步骤：

19、(1)将样品于水中溶解并定容，然后混合均匀并超声处理，得到第一混合液；

20、(2)取适量的第一混合液的上清液，加入磷酸盐缓冲溶液和淀粉葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，得到第二混合液；

21、(3)将第二混合液在50～65℃保温60～120min进行酶解，得到酶解液；

22、(4)将酶解液在90～100℃保温5～6min后，再放置到4℃～室温冷却，得到灭酶后的混合物，然后取适量的灭酶后的混合物，加入2-氨基苯甲酰胺溶液，在55～65℃保温60～120min进行衍生，得到衍生液；

23、(5)将所述衍生液放置到室温冷却后，加入乙腈溶液，混合均匀，过滤膜后，进行液相色谱检测。

24、在上述的方法中，优选地，基于液相色谱检测结果，采用混合有乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的标准标尺工作液和昆布三糖标准系列工作液对样品进行定性分析和定量分析包括：

25、分别配制混合有乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的标准标尺工作液和昆布三糖标准系列工作液，然后分别取适量的标准标尺工作液、标准系列工作液，加入乙酸铵溶液和磷酸盐缓冲溶液，混合均匀；然后在50～65℃保温60～120min；之后在90～100℃保温5～6min后，再放置到4℃～室温冷却，然后分别取适量的标准标尺工作液、标准系列工作液，加入2-氨基苯甲酰胺溶液，在55～65℃保温60～120min进行衍生，放置到室温冷却后，加入乙腈溶液，混合均匀后，过滤膜，之后分别进行液相色谱检测。其中，更优选地，所述乙酸铵溶液的浓度为0.19～0.21mol/l，ph值为4.4-4.6。更优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.19～0.21mol/l(以溶液中磷酸盐的总摩尔量计)，ph值为5.5～6.5，其具体配制步骤如上文所述。更优选地，所述标准标尺工作液、所述磷酸盐缓冲溶液与所述乙酸铵溶液的体积比为500:50:200。更优选地，所述昆布三糖标准系列工作液、所述磷酸盐缓冲溶液与所述乙酸铵溶液的体积比为500:50:200(即，昆布三糖标准系列工作液中的每个工作液与所述磷酸盐缓冲溶液、所述乙酸铵溶液的体积比均为500:50:200)。更优选地，加入乙酸铵溶液和磷酸盐缓冲溶液后的标准标尺工作液与2-氨基苯甲酰胺溶液的体积比为20:200。更优选地，加入乙酸铵溶液和磷酸盐缓冲溶液后的标准系列工作液与2-氨基苯甲酰胺溶液的体积比分别为20:200。更优选地，所述2-氨基苯甲酰胺溶液为浓度为0.34～0.36mol/l的2-氨基苯甲酰胺和浓度为0.9～1.1mol/l的氰基硼氢化钠的乙酸-二甲基亚砜混合溶液；尤为优选地，乙酸与二甲基亚砜的体积比为3:7；其具体配制步骤如上文所述。更优选地，衍生后的标准标尺工作液与所述乙腈溶液的体积比为220:1000。更优选地，衍生后的标准系列工作液与所述乙腈溶液的体积比分别为220:1000。更优选地，所述乙腈溶液的质量浓度为75％～100％。优选地，所述滤膜为0.22μm～0.45μm的有机滤膜。

26、在上述的方法中，优选地，所述定性分析包括：

27、基于标准标尺工作液的液相色谱检测结果得到麦芽糖系列化合物的相对保留时间，建立麦芽糖的聚合度与相对保留时间的关系曲线，获得麦芽糖系列化合物的相对保留时间与麦芽糖的聚合度的关系式；

28、基于麦芽糖的相对保留时间与麦芽糖的聚合度的关系式，结合不同聚合度的低聚半乳糖对应的gu(glucose unit，葡萄糖单位)值范围确定不同聚合度的低聚半乳糖的起始相对保留时间、中止相对保留时间；

29、基于不同聚合度的低聚半乳糖的起始相对保留时间、中止相对保留时间获得不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间、中止保留时间；

30、基于不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间、中止保留时间进行定性分析。

31、在上述的方法中，优选地，所述基于标准标尺工作液的液相色谱检测结果得到麦芽糖系列化合物的相对保留时间，建立麦芽糖的聚合度与相对保留时间的关系曲线，获得麦芽糖系列化合物的相对保留时间与麦芽糖的聚合度的关系式包括：

32、基于液相色谱分析结果，通过标准标尺工作液的色谱图得出麦芽糖系列化合物的相对保留时间，建立麦芽糖的聚合度与相对保留时间的关系曲线，然后进行三项式分布拟合，获得麦芽糖系列化合物的相对保留时间与麦芽糖的聚合度的关系式，即y＝ax3+bx2+cx+d；其中，y为麦芽糖系列化合物的相对保留时间rrt(dp)，x为麦芽糖的聚合度，a、b、c、d为系数。

33、在上述的方法中，优选地，基于标准标尺工作液的液相色谱检测结果得到麦芽糖系列化合物的相对保留时间是通过以下公式(1)计算得到的：

34、

35、公式(1)中：

36、rt(dp)—基于标准标尺工作液的液相色谱检测结果得到的麦芽糖系列化合物的保留时间，单位为min；

37、rt(s)—基于昆布三糖标准系列工作液的液相色谱得到的昆布三糖的保留时间，单位为min；

38、rrt(dp)—麦芽糖系列化合物的相对保留时间。

39、在上述的方法中，优选地，基于麦芽糖的相对保留时间与麦芽糖的聚合度的关系式，结合不同聚合度的低聚半乳糖对应的gu值范围确定不同聚合度的低聚半乳糖的起始相对保留时间、中止相对保留时间包括：

40、将不同聚合度的低聚半乳糖对应的gu值范围的上限值、下限值分别代入所述麦芽糖的相对保留时间与麦芽糖的聚合度的关系式，计算得到相应的保留时间，分别作为不同聚合度的低聚半乳糖的起始相对保留时间、中止相对保留时间；

41、其中，下限值的计算结果作为起始相对保留时间、上限值的计算结果作为中止相对保留时间。

42、在上述的方法中，优选地，不同聚合度的低聚半乳糖所对应的gu值的范围如下表所示：

43、 gu值的范围 低聚半乳糖聚合度 1.6～2.5 2 2.6～3.4 3 3.4～4.2 4 4.2～5.2 5 5.2～6.2 6 ＞6.2 7

44、。

45、在上表中，本领域技术人员应当理解，当上表中gu值的范围为＞6.2时，也就是低聚半乳糖的聚合度为7时，gu值代入所述麦芽糖的相对保留时间与麦芽糖的聚合度的关系式，计算得到相应的保留时间并无明确的上限值，因此大于该计算得到的相对保留时间的值为聚合度为7的低聚半乳糖相对保留时间。

46、在上述的方法中，优选地，基于不同聚合度的低聚半乳糖的起始相对保留时间、中止相对保留时间获得不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间、中止保留时间通过以下公式进行：

47、rrt＝rt/rt(s)

48、其中：rrt代表不同聚合度的低聚半乳糖的起始相对保留时间、中止相对保留时间；

49、rt代表不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间、中止保留时间，单位为min；

50、rt(s)代表基于昆布三糖标准系列工作液的液相色谱得到的昆布三糖的保留时间，单位为min。

51、在上述的方法中，优选地，基于不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间、中止保留时间进行定性分析包括：

52、不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间、中止保留时间所组成的范围作为判断样品的色谱图中各聚合度的低聚半乳糖的保留时间段的标准，进而对样品进行定性分析；

53、其中，不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间作为范围的下限值、不同聚合度的低聚半乳糖的中止保留时间作为范围的上限值。

54、在上述的方法中，优选地，所述定量分析包括：

55、根据不同聚合度的低聚半乳糖的起始保留时间、中止保留时间得到各聚合度的低聚半乳糖的保留时间段，分别记录样品的色谱图中各聚合度的低聚半乳糖保留时间段中的峰面积之和，然后根据昆布三糖标准系列工作液的色谱图绘制的标准曲线分别获得样品中不同聚合度的低聚半乳糖的上机浓度(上机浓度是指进行液相色谱检测的样品中的相应化合物的浓度)；

56、根据不同聚合度的低聚半乳糖的上机浓度确定样品中不同聚合度的低聚半乳糖的含量以及样品中低聚半乳糖的总含量。

57、在上述的方法中，优选地，根据不同聚合度的低聚半乳糖的上机浓度确定样品中不同聚合度的低聚半乳糖的含量通过以下公式(2)和公式(3)计算：

58、

59、

60、公式(2)中：

61、ρdp2—通过昆布三糖标准曲线计算得到的样品中聚合度为2的低聚半乳糖的上机浓度，单位为μg/ml；

62、ρlactose—通过昆布三糖标准曲线计算得到的样品中乳糖的上机浓度，单位为μg/ml；乳糖的峰面积通过标准标尺工作液中的乳糖的保留时间在样品的色谱图中确定；

63、ρ0—d组实验得到的色谱图中以各聚合度的低聚半乳糖的保留时间段确定的各峰面积之和并通过昆布三糖标准曲线计算得到的相应上机浓度，单位为μg/ml；

64、v—步骤(1)中样品的定容体积，单位为ml；

65、m—步骤(1)中样品的称样量，单位为g；

66、10000—换算系数；

67、x(dp2)—样品中聚合度为2的低聚半乳糖的含量，单位为g/100g；

68、公式(3)中：n＝3～7；

69、ρdpn—通过昆布三糖标准曲线得到的样品中聚合度为3～7的低聚半乳糖的上机浓度，单位为μg/ml；

70、ρ0—d组实验得到的色谱图中以各聚合度的低聚半乳糖的保留时间段确定的各峰面积之和并通过昆布三糖标准曲线计算得到的相应上机浓度，单位为μg/ml；

71、v—步骤(1)中样品的定容体积，单位为ml；

72、m—步骤(1)中样品的称样量，单位为g；

73、10000—换算系数；

74、x(dpn)—样品中聚合度为n的低聚半乳糖的含量，单位为g/100g；

75、样品中低聚半乳糖的总含量通过以下公式(4)计算：

76、x(dp总)＝x(dp2)+x(dpn)……………………(4)

77、公式(4)中：n＝3～7；

78、x(dp2)—样品中聚合度为2的低聚半乳糖的含量，单位为g/100g；

79、x(dpn)—样品中聚合度为n的低聚半乳糖的含量，单位为g/100g；

80、x(dp总)—样品中各聚合度的低聚半乳糖的总含量，单位为g/100g；

81、其中，d组实验包括以下步骤：

82、d-(1)在水中加入磷酸盐缓冲溶液和淀粉葡萄糖苷酶溶液，混合均匀；

83、d-(2)将步骤d-(1)得到的混合溶液在50～65℃保温60～120min(更优选为在60℃保温60min)，然后在90～100℃保温5～6min后，再放置到4℃～室温冷却，然后取适量的混合溶液，加入2-氨基苯甲酰胺溶液，在55～65℃(更优选为60℃)保温60～120min，之后放置到室温冷却，加入乙腈溶液，混合均匀后，过滤膜后，进行液相色谱检测，以判断磷酸盐缓冲溶液和淀粉葡萄糖苷酶中是否存在其他还原性物质的干扰。

84、在上述方法中，优选地，在步骤d-(2)中，判断磷酸盐缓冲溶液和淀粉葡萄糖苷酶中是否存在其他还原性物质的干扰的标准为：如果步骤d-(2)液相色谱检测得到的混合溶液中还原性物质总量≤根据样品的色谱图得出的样品中还原性物质总量(即，样品实验组的测定值，称为b组)，并且步骤d-(2)测定得到的混合溶液中还原性物质总量＜定量限，所述定量限为0.3g/100g，那么则混合溶液中无其他还原性物质的干扰。其中，d组实验的还原性物质总量是通过d组实验得到的色谱图中以各聚合度的低聚半乳糖的保留时间段确定的各峰面积之和并通过昆布三糖标准曲线计算得到相应上机浓度之后计算出的混合溶液中还原性物质总量。

85、在上述的步骤d-(1)至d-(2)中，本发明设置了样品实验组的空白对照组(称为d组)，对磷酸盐缓冲溶液、淀粉葡萄糖苷酶试剂进行测定，以确认磷酸盐缓冲溶液、淀粉葡萄糖苷酶的混合物没有对实验造成干扰。在确认无干扰后，相同试剂可以不再重复进行上述的步骤d-(1)至d-(2)。如果存在干扰，则更换相应试剂。

86、根据本发明的具体实施方式，优选地，上述测定食品中低聚半乳糖含量的方法还包括以下步骤(即，a组实验)：

87、a-(1)将样品于水中溶解并定容，然后混合均匀并超声处理；

88、a-(2)取适量步骤a-(1)得到的混合物的上清液，加入β-半乳糖苷酶溶液和淀粉葡萄糖苷酶溶液，混合均匀；

89、a-(3)将步骤a-(2)得到的混合物在50～65℃保温60～120min进行酶解；

90、a-(4)将步骤a-(3)得到的酶解后的混合物在90～100℃保温5～6min后，再放置到4℃～室温冷却，得到灭酶后的混合物，然后取适量的灭酶后的混合物，加入2-氨基苯甲酰胺溶液，在55～65℃保温60～120min进行衍生；

91、a-(5)将步骤a-(4)得到的混合物放置到室温冷却，加入乙腈溶液，混合均匀后，过滤膜后，进行液相色谱检测，以判断样品中是否存在其他还原性物质的干扰。

92、在上述方法中，优选地，在步骤a-(5)中，判断样品中是否存在其他还原性物质的干扰的标准为：如果步骤a-(5)液相色谱检测得到的样品中还原性物质总量＜定量限，所述定量限为0.3g/100g，那么则样品中无其他还原性物质的干扰。其中，a组实验的还原性物质总量是通过步骤a-(5)得到的色谱图中以各聚合度的低聚半乳糖的保留时间段确定的各峰面积之和并通过昆布三糖标准曲线计算得到相应上机浓度之后计算出的样品中的还原性物质总量，也就是采用β-半乳糖苷酶和淀粉葡萄糖苷酶酶解后的样品中还原性物质总量。

93、在上述的步骤a-(1)至a-(5)中，本发明设置了样品的对照组(称为a组)，加入β半乳糖苷酶定向酶解低聚半乳糖，以排除样品中其他还原性物质的干扰。在确认相同基质的样品无其他还原性物质干扰时(判定标准为还原性物质总量＜定量限)，那么相同基质的样品可不重复进行上述的步骤a-(1)至a-(5)。若样品中存在其他还原性物质干扰时，则本发明的方法不再适用。

94、根据本发明的具体实施方式，优选地，上述测定食品中低聚半乳糖含量的方法还包括以下步骤(即，c组实验)：

95、c-(1)在水中加入β-半乳糖苷酶溶液和淀粉葡萄糖苷酶溶液，混合均匀；

96、c-(2)将步骤c-(1)得到的混合溶液在50～65℃保温60～120min(更优选为在60℃保温60min)，然后在90～100℃保温5～6min后，再放置到4℃～室温冷却，然后取适量的混合溶液，加入2-氨基苯甲酰胺溶液，在55～65℃(更优选为60℃)保温60～120min，之后放置到室温冷却，加入乙腈溶液，混合均匀后，过滤膜后，进行液相色谱检测，以判断β-半乳糖苷酶和淀粉葡萄糖苷酶中是否存在其他还原性物质的干扰；

97、在上述方法中，优选地，在步骤c-(2)中，判断β-半乳糖苷酶和淀粉葡萄糖苷酶中是否存在其他还原性物质的干扰的标准为：如果步骤c-(2)液相色谱检测得到的混合溶液中还原性物质总量≤步骤a-(5)中得出的样品中还原性物质总量(即，a组测定值)，并且步骤c-(2)液相色谱检测得到的混合溶液中还原性物质总量＜定量限，所述定量限为0.3g/100g，那么则混合溶液中无其他还原性物质的干扰。其中，c组实验的还原性物质总量是通过步骤c-(2)得到的色谱图中以各聚合度的低聚半乳糖的保留时间段确定的各峰面积之和并通过昆布三糖标准曲线计算得到相应上机浓度之后计算出的样品中的还原性物质总量。有些厂家的β-半乳糖苷酶在单独测定时(将c组实验中淀粉葡萄糖苷酶替换成等量的溶酶试剂)，在对酶进行确认并且有还原性物质干扰，但在加入淀粉葡萄糖苷酶之后，测定还原性物质总量＜定量限，也可不进行该组试验，如有干扰则更换相应试剂。

98、在上述的步骤c-(1)至c-(2)中，本发明设置了a组的空白对照组(称为c组)，对β-半乳糖苷酶试剂、淀粉葡萄糖苷酶试剂进行测定，以确认β-半乳糖苷酶、淀粉葡萄糖苷酶的混合物没有对实验造成干扰。在确认无干扰后，相同试剂可以不再重复进行上述的步骤c-(1)至c-(2)。如果存在干扰，则更换相应试剂。

99、在上述方法中，优选地，在步骤(1)、步骤a-(1)中，所述样品为均质后的样品。所述均质的具体操作条件可以为本领域常规的。

100、在上述方法中，优选地，在步骤(1)、步骤a-(1)中，所述的混合为涡旋混合，所述涡旋混合的时间为10～30s。

101、在上述方法中，优选地，在步骤(1)、步骤a-(1)中，所述超声处理的时间为20～30min。本发明采用超声的方式来提取样品中的低聚半乳糖。

102、在上述方法中，优选地，在步骤(1)、步骤a-(1)中，所述样品与水的比例为1g：50ml。

103、在上述方法中，优选地，在步骤(2)、步骤a-(2)、步骤c-(1)、步骤d-(1)中，所述的混合为涡旋混合；优选地，所述涡旋混合的时间为10～30s。

104、在上述方法中，优选地，在步骤(2)中，所述上清液、所述磷酸盐缓冲溶液和所述淀粉葡萄糖苷酶溶液的体积比为500:50:200。

105、在上述方法中，优选地，在步骤d-(1)中，水、磷酸盐缓冲溶液和淀粉葡萄糖苷酶溶液的体积比为500:50:200。

106、在上述方法中，优选地，在步骤(2)、步骤d-(1)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.19～0.21mol/l(以溶液中磷酸盐的总摩尔量计)，ph值为5.5～6.5，其具体配制步骤如上文所述。

107、在上述方法中，优选地，在步骤(2)、步骤a-(2)、步骤c-(1)、步骤d-(1)中，所述淀粉葡萄糖苷酶溶液的酶活力为150～180u/ml。所述淀粉葡萄糖苷酶溶液的具体配制步骤如上文所述。

108、在上述方法中，优选地，在步骤a-(2)中，步骤a-(1)得到的混合物的上清液、所述β-半乳糖苷酶溶液和所述淀粉葡萄糖苷酶溶液的体积比为500:50:200。

109、在上述方法中，优选地，在步骤a-(2)、步骤c-(1)中，所述β-半乳糖苷酶溶液的酶活力为200～500u/ml。更优选地，所述β-半乳糖苷酶溶液是通过以下步骤配制的：将酶活力约为200～500u的β-半乳糖苷酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到酶活力为200～500u/ml的β-半乳糖苷酶溶液。其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.19～0.21mol/l(以溶液中磷酸盐的总摩尔量计)，ph值为5.5～6.5，其具体配制步骤如上文所述。

110、在上述方法中，优选地，在步骤(3)、步骤a-(3)中，在50～65℃保温的时间为60min。更优选地，在步骤(3)、步骤a-(3)中，所述50～65℃保温是在50～65℃水浴锅中进行。更优选地，在步骤(3)、步骤a-(3)中，酶解的温度为50～60℃，尤为优选为60℃。

111、在上述方法中，优选地，在步骤(4)、步骤a-(4)中，灭酶后的混合物与所述2-氨基苯甲酰胺溶液的体积比为20:200。

112、在上述方法中，优选地，在步骤c-(2)、步骤d-(2)中，所述混合溶液与所述2-氨基苯甲酰胺溶液的体积比为20:200。

113、在上述方法中，优选地，在步骤(4)、步骤a-(4)、步骤c-(2)、步骤d-(2)中，所述2-氨基苯甲酰胺溶液为浓度为0.34～0.36mol/l的2-氨基苯甲酰胺和浓度为0.9～1.1mol/l的氰基硼氢化钠的乙酸-二甲基亚砜混合溶液。其中，更优选地，乙酸与二甲基亚砜的体积比可以为3:7。所述2-氨基苯甲酰胺溶液的具体配制步骤如上文所述。

114、在上述方法中，优选地，在步骤(4)、步骤a-(4)、步骤c-(2)、步骤d-(2)中，所述90～100℃保温是在90～100℃水浴锅中进行，所述55～65℃保温是在55～65℃水浴锅中进行。

115、在上述方法中，优选地，在步骤(5)中，所述衍生液与所述乙腈溶液的体积比为220:1000。

116、在上述方法中，优选地，在步骤a-(5)中，步骤a-(4)得到的混合物与所述乙腈溶液的体积比为220:1000。

117、在上述方法中，优选地，在步骤c-(2)、步骤d-(2)中，加入2-氨基苯甲酰胺溶液后的混合溶液与所述乙腈溶液的体积比为220:1000。

118、在上述方法中，优选地，在步骤(5)、步骤a-(5)、步骤c-(2)、步骤d-(2)中，所述乙腈溶液的质量浓度为75％～100％。

119、在上述方法中，优选地，在步骤(5)、步骤a-(5)、步骤c-(2)、步骤d-(2)中，所述的混合为涡旋混合；优选地，所述涡旋混合的时间为10～30s。

120、在上述方法中，优选地，在步骤(5)、步骤a-(5)、步骤c-(2)、步骤d-(2)中，所述滤膜为0.22μm～0.45μm的有机滤膜。

121、在上述方法中，优选地，所述液相色谱的检测条件为：色谱柱：酰胺基键合的表面多孔型硅胶色谱柱；流动相：流动相a：甲酸铵溶液；流动相b：乙腈；流动相流速：1.0ml/min；检测器：荧光检测器，激发波长354～356nm，发射波长429～431nm；柱温：20～30℃。其中，更优选地，所述色谱柱的内径为150mm×4.6mm，粒径为2.7μm。更优选地，所述甲酸铵溶液的浓度为50mmol/l，ph值为4.3-4.5。

122、在上述方法中，优选地，混合有乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的标准标尺工作液中的乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的浓度分别为10～100.00μg/ml；昆布三糖标准系列工作液的浓度包括：1.00μg/ml、10.00μg/ml、50.00μg/ml、100.00μg/ml、250.00μg/ml和500.00μg/ml。

123、本发明采用的系列标准品由麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、乳糖和昆布三糖组成，标准品只进行衍生不进行酶解，基于这些系列标准品来对样品中的低聚半乳糖进行定性分析和定量计算。

124、在上述方法中，各个步骤所采用的水均可以为超纯水。

125、在上述方法中，优选地，所述的样品包括乳制品；更优选地，所述样品为转糖基β-半乳糖苷酶生产的含低聚半乳糖的牛奶和/或酸奶。

126、本发明的检测方法适合于各种食品中低聚半乳糖含量的测定，并且能够得到其中的不同聚合度的低聚半乳糖的含量以及低聚半乳糖的总量，尤其适合于对乳制品进行检测。对于转糖基β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的牛奶和酸奶中gos含量的测定而言，由于该类样品属于直接利用产品中的乳糖成分，通过酶聚合成gos，这样无法利用外源添加的原料作为对照品来检测的技术思路。其次，由于该类样品中残留乳糖含量不确定，并且由于工艺条件不同，平均聚合度也大不相同，这样无法利用离子色谱法通过半乳糖增量来换算的技术思路。此外，液相色谱双柱法并不适合测定基质复杂的样品。而本发明的检测方法能够准确测定转糖基β-半乳糖苷酶生产的含低聚半乳糖的牛奶和/或酸奶产品中的低聚半乳糖含量并得到不同聚合度的低聚半乳糖的含量。

127、本发明的方法先通过淀粉葡萄糖苷酶水解去除样品中麦芽糊精和淀粉的干扰，再采用2-氨基苯甲酰胺对还原糖进行胺化反应衍生，衍生后的不同gos成分会产生相同的摩尔灵敏度荧光响应。本发明对样品的处理过程中采用了先酶解后衍生的顺序，使检测结果更为准确。同时，本发明的方法使用了β-半乳糖苷酶酶解样品，定向酶解低聚半乳糖，通过酶解后的样品作为对照，排除其他还原性物质的干扰，使方法产生特异性。并且，本发明的方法采用麦芽糖系列标准品进行定性，采用昆布三糖系列标准品作为对照品以外标法进行定量，并采用液相色谱-荧光检测器进行检测。本发明的方法利用麦芽糖系列标准品与昆布三糖系列标准品相对保留时间与聚合度呈三项式分布关系，进而可判断样品中低聚半乳糖的不同聚合度分布。同时，本发明的方法通过计算不同聚合度的低聚半乳糖的含量，能够判断不同条件下产生的样品中gos聚合度含量以及占比。此外，昆布三糖为一般食品中，包括乳制品中，所不含有的一种糖，性质相对稳定，本发明采用其作为标准品可对gos进行定量测定以及辅助对不同聚合度的gos进行定性判断，并对测定无干扰。另外，不同聚合度的gos的判断比较复杂，现有技术均需要借助质谱来对不同聚合度的gos进行定性测定和判断，而本发明的方法无需借助质谱，在实用性上具有良好的价值。

128、本发明的方法能够对样品中低聚半乳糖各聚合度的含量进行测定。在低聚半乳糖的生产过程中，部分半乳糖苷酶主要催化生产出高比例的低聚半乳糖二糖，这部分半乳二糖会被小肠吸收，消弱益生作用，从而降低gos产品的整体益生价值，各聚合度的含量测定可以监控gos的整体益生价值并且可以指导工艺研究。

129、综上所述，本发明的方法不受样品中乳糖含量高低的限制，不需要借助原料等对照品做对照，可以准确判断gos不同聚合度的含量及其占比以及gos总含量，解决了以往方法的诸多缺陷，具有准确度高、重复性好、衍生物稳定、方法简单、快速、准确、高效等优点，具有较强的应用价值。