一种硫酸卡那霉素的SERS检测方法与流程

一种硫酸卡那霉素的sers检测方法
技术领域
1.本发明涉及硫酸卡那霉素的检测技术，尤其是涉及银纳米粒子作为sers基底的一种硫酸卡那霉素的sers检测方法。


背景技术：

2.硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)是一种氨基糖苷类抗生素，主要由氨基环醇和氨基糖通过氧桥连接而成的苷类化合物(丁大连,richard salvi.高浓度的kana会对耳朵、肾脏等部位产生明显伤害[j].中华耳科学杂志,2007(02):125-131.)。卡那霉素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，是目前我国畜牧业、农业和水产业中常用的兽药之一。然而，它的滥用可通过动物来源的食物积累，比如猪肉、牛肉等肉类以及奶制品和鸡蛋，影响到人类的最终摄入量。人类在食用卡那霉素超标的食物时，不仅会引发例如耳聋、肾病及心血管疾病等，而且动物体中的耐药致病菌感染人体正常细菌产生耐药性。为了保障食品安全，许多国家和地区对卡那霉素最大残留限量(maximum residue limits，mrls)均有规定，我国gb 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定卡那霉素在牛奶中的最高残留限量分别为150μg/kg(卢阳,陈晋元,贺兆源,郭亚文,王波,谢恺舟.中国与国外牛、羊肉及其产品兽药残留限量标准的对比研究[j].中国兽药杂志,2020,54(11):57-64.)，欧盟规定在牛奶中卡那霉素的最高残留限量为150μg/kg(official journal of european union.commission decision(eu)no37/2010on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin[eb/ol].[2009-12-22][j].)。因此，兽药残留监测是保障食品安全的重要问题，开发一种卡那霉素药物残留高灵敏、高选择性的测定方法是必要的。
[0003]
目前报道的卡那霉素的检测方法主要有微生物测定法、色谱法、毛细管电泳(ce)、免疫测定、荧光和紫外光谱(国家药典委员会编.中华人民共和国药典[s].二部.北京：化学工业出版社,2000；zhang x.,et al.determination of kanamycin by high performance liquid chromatography[j].molecules,2019,24(10)；manyanga v.,et al.improved liquid chromatographic method with pulsed electrochemical detection for the analysis of kanamycin[j].journal of chromatography a,2010,1217(24)：3748-3753；long y.h.,et al.determination of kanamycin in serum by solid-phase extraction,pre-capillary derivatization and capillary electrophoresis[j].journal of chromatography b,2003,784(2)：255-264；kloth k.,et al.a regenerable immunochip for the rapid determination of 13different antibiotics in raw milk[j].analyst,2009,134(7)：1433-1439；liao q.g.,wei b.h.,luo l.g.aptamer based fluorometric determination of kanamycin using double-stranded dna and carbon nanotubes[j].microchimica acta,2017,184(2)：627-632.)。微生物测定法是传统的检测方法，但存在培养时间长，误差大等缺点；毛细管电泳法所需仪器昂贵、方法复杂、耗时且需
要繁琐的样品预处理，不适合大量样品的常规分析。液相色谱是最常用的方法，但由于卡那霉素极性很强，并且缺少发色团，需要衍生化；或者高效液相色谱结合通用检测系统，如蒸发光散射检测(elsd)、脉冲安培检测器(pad)和质谱(ms)(megoulas n.c.,koupparis m.a.direct determination of kanamycin in raw materials,veterinary formulation and culture media using a novel liquid chromatography-evaporative light scattering method[j].analytica chimica acta,2005,547(1)：64-72；zhang y.,et al.hplc-elsd determination of kanamycin b in the presence of kanamycin a in fermentation broth[j].biomedical chromatography,2015,29(3)：396-401；hanko v.p.,rohrer j.s.determination of tobramycin and impurities using high-performance anion exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection[j].journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2006,40(4)：1006-1012；fujii y.,kaga t.,nishimura k.simultaneous determination of aminoglycoside residues in livestock and fishery products by phenylboronic acid solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[j].analytical sciences,2019,35(9)：961-966.)，这些检测技术虽然灵敏性高，特异性强，但价格昂贵，往往要求液相色谱采用挥发性离子试剂作为流动相，分析时对仪器和色谱柱的损伤大，需要对离子源和色谱定期清洗以防污染和灵敏度下降，因而不适用于大批量样品的检测。
[0004]
而贵金属纳米结构表面等离激元共振(spr)因其广泛的用途而备受关注,它不仅可以催化某些特殊的表面反应，同时还能产生表面增强拉曼散射效应(sers)，极大增强分子的表面拉曼信号(金向鹏,李幸佳,张晨杰,袁亚仙,姚建林.金膜表面等离激元诱导邻巯基苯甲酸脱羧反应的表面增强拉曼光谱研究[j].光谱学与光谱分析,2021,41(10):3153-3158.)。
[0005]
目前针对硫酸卡那霉素的sers检测的报道，主要是基于适配体的一些较新的检测方法，例如，zengin等(zengin a.,tamer u.,caykara t.extremely sensitive sandwich assay of kanamycin using surface-enhanced raman scattering of 2-mercaptobenzothiazole labeled gold@silver nanoparticles[j].analytica chimica acta,2014,817：33-41)公开杂交mnps和2-巯基苯并噻唑(mbt)标记au@ag nps作为sers基底与卡那霉素适配体结合检测牛奶中的卡那霉素的传感器，检出限为2pg/ml；jiang等(jiang y.f.,et al.ultrasensitive analysis of kanamycin residue in milk by sers-based aptasensor[j].talanta,2019,197：151-158；)公开双链dna结合双金属金@银纳米颗粒作为基底与卡那霉素适配体结合检测牛奶中的卡那霉素，检出限达到0.90pg/ml；jiang等(jiang y.f.,et al.a simple and sensitive aptasensor based on sers for trace analysis of kanamycin in milk[j].journal of food measurement and characterization,2020,14(6)：3184-3193)公开4-mba标记au@ag nps与卡那霉素适配体结合的基于sers的适配体传感器检测牛奶中的卡那霉素，检出限为142pg/ml。但大多sers检测采用au@ag修饰抗生素适配体分子作为sers基底，选择性较好，但基底合成复杂只能检测一种，并且核酸适配体结构容易受环境影响，特异性不稳定；已经研究获得的特异性核酸适配体种类少。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供简单、快速、加标回收率高、结果可靠的一种硫酸卡那霉素的sers检测方法。sers基底的制备和硫酸卡那霉素的sers检测。通过银纳米粒子作为sers基底，对卡那霉素进行定量分析。在优化了银溶胶与硫酸卡那霉素和盐酸的结合量比条件下，卡那霉素的线性检测范围为100ppm～10ppb，检测限为10ppb，sers强度的相对标准偏差小于10％。银溶胶作为sers基底具有低成本、可控性、检测效率高等优点，在sers检测抗生素等方面能够进行实际检测的普及应用。且该方法操作简便、准确性和灵敏度高、且不需要复杂的操作技术，满足大批量及快速分析检测的要求。
[0007]
本发明包括以下步骤：
[0008]
1)柠檬酸钠还原硝酸银制备ag纳米粒子溶胶；
[0009]
在步骤1)中，所述柠檬酸钠还原硝酸银制备ag纳米粒子溶胶，可通过控制反应物的浓度、反应温度、反应时间、搅拌速度，制得粒径均一的ag纳米粒子溶胶，具体步骤可为：取agno3溶液于烧瓶中，搅拌加热至沸腾回流状态，加入柠檬酸钠，至溶液变为略带绿色的不透明液体，继续加热回流50min～60min，停止加热后，自然冷却至室温，密封避光保存；
[0010]
所述柠檬酸钠的质量浓度分数为0.8％～1.5％，柠檬酸钠与硝酸银的体积比为30～50；所述硝酸银的浓度为1～3mmol/l；
[0011]
所述反应温度可为90～100℃，反应时间为30～80min，搅拌速度为1000～1500r/min；所述ag纳米粒子为球形纳米粒子或椭圆形纳米粒子，所述球形ag纳米粒子的粒径约为50
±
10nm。
[0012]
所述用柠檬酸钠还原硝酸银制备ag纳米粒子溶胶的反应条件为：在磁力搅拌下加热回流至沸腾，然后迅速加柠檬酸钠，继续加热回流50～60min，反应后自然冷却至室温。
[0013]
所述柠檬酸钠还原硝酸银制备ag纳米粒子溶胶具体步骤可为：取100ml agno3溶液于单口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器搅拌同时用电热套加热至沸腾回流状态，迅速加入预先配制好柠檬酸钠，加入之后约1min左右，溶液由无色变成乳白，再变成略带绿色的不透明液体，继续搅拌加热微沸50～60min，再撤离加热套停止加热，自然冷却至室温，再用铝箔纸覆盖圆底烧瓶密封避光保存。
[0014]
2)硫酸卡那霉素在sers基底上的定量分析检测。
[0015]
在步骤2)中，所述硫酸卡那霉素在sers基底上的定量分析检测的具体方法为：在最佳激发波长下，将不同浓度的硫酸卡那霉素溶液与sers基底和盐酸按照最佳结合量比混合，进行表面增强拉曼检测，随着硫酸卡那霉素浓度的增加，硫酸卡那霉素在特定波长处的拉曼峰逐渐增强，利用硫酸卡那霉素拉曼特征峰的强度与硫酸卡那霉素的量之间关系建立标准曲线，对硫酸卡那霉素进行定量分析检测。
[0016]
所述最佳激发波长是指785nm激发波长；所述硫酸卡那霉素在特定波长处的拉曼峰是指硫酸卡那霉素在456cm-1
和536cm-1
处的特征拉曼峰；
[0017]
所述定量分析检测是指以浓度的对数值为横坐标，即以硫酸卡那霉素浓度的对数为横坐标，以硫酸卡那霉素在最强特征峰456cm-1
和536cm-1
处的峰强为纵坐标，建立标准曲线，对硫酸卡那霉素定量检测，检测范围1000ppm～10ppb，线性范围100ppm～10ppb，线性相关系数r2为0.98785～0.99216，检测限10ppb，sers强度的相对标准偏差小于10％。
[0018]
所述最佳结合量比(银溶胶:硫酸卡那霉素:盐酸)为1:0.8:0.6。所述盐酸的浓度
为1～2mol/l，混合后最佳检测时间是0～1min以内。
[0019]
所述不同浓度的硫酸卡那霉素溶液是指水作为配制硫酸卡那霉素的最佳溶剂。
[0020]
本发明以柠檬酸钠还原硝酸银制备银纳米粒子作为sers基底。sers基底不仅具有优异的sers拉曼增强效果，优异的稳定性、灵敏性，同时，sers基底过程简单、成本低廉、重复性高、检测灵敏度优异、检测方法简便易操作。选用硫酸卡那霉素(kana)作为目标分子，并且通过加入一定体积的盐酸，测试以银溶胶作为sers基底对硫酸卡那霉素的拉曼增强效果。实验结果表明：银溶胶作为sers基底具有优异的拉曼增强效果。利用硫酸卡那霉素在456cm-1
、536cm-1
处的特征拉曼峰的信号强度与浓度成正比例，建立简单、快速、低成本，无需复杂的特异性修饰，直接利用硫酸卡那霉素的sers特征峰对其进行定量的分析方法。本发明的线性范围100ppm～10ppb，线性相关系数0.98785～0.99216，检测限10ppb。
附图说明
[0021]
图1为制备的agnps在加入硫酸卡那霉素和盐酸后的表面等离子体共振吸收谱图。
[0022]
图2为agnps在加入不同体积盐酸的拉曼谱图。
[0023]
图3为agnps在加入不同体积卡那霉素的拉曼谱图。
[0024]
图4为kana平行十次测量后得到的拉曼谱图。
[0025]
图5为1ppm硫酸卡那霉素在sers基底上平行10次测量后不同位点的sers峰强的柱状图。
[0026]
图6为不同浓度硫酸卡那霉素的sers谱图。
[0027]
图7为硫酸卡那霉素在最强拉曼峰456cm-1
和536cm-1
处的sers强度与浓度对数的关系图。
[0028]
图8为牛奶中不同浓度硫酸卡那霉素加标提取液的sers谱。
具体实施方式
[0029]
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0030]
本发明实施例包括以下步骤：
[0031]
1)合成ag纳米粒子：合成粒径约55nm的ag纳米粒子：预先配制质量分数1％的柠檬酸钠，配制1mmol/l的agno3溶液，取100ml配置好的agno3溶液于单口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器搅拌同时用电热套加热至沸腾回流状态，迅速加入预先配制好的3ml 1％的柠檬酸钠，加入之后约1min左右，溶液由无色变成乳白，再变成略带绿色的不透明液体，继续搅拌加热微沸1h，再撤离加热套停止加热，自然冷却至室温，再用铝箔纸覆盖圆底烧瓶密封避光保存；
[0032]
2)硫酸卡那霉素在sers基底上的定量分析检测：在最佳激发波长下、最佳硫酸卡那霉素添加量以及最佳盐酸添加量的条件下，取不同浓度的硫酸卡那霉素溶液与盐酸和sers基底按照最佳结合量比混合，进行表面增强拉曼检测，随着硫酸卡那霉素浓度的增加，硫酸卡那霉素在特定波长处的拉曼峰逐渐增强，利用硫酸卡那霉素拉曼特征峰的强度与硫酸卡那霉素的浓度建立标准曲线，对硫酸卡那霉素进行定量分析检测；所述最佳激发波长是指785nm激发波长；所述不同浓度的硫酸卡那霉素溶液是指水作为配制硫酸卡那霉素的最佳溶剂；所述最佳结合量比(银溶胶:硫酸卡那霉素:盐酸)为1:0.8:0.6；所述盐酸的浓度
为1～2mol/l，混合后最佳检测时间是0～1min以内；所述硫酸卡那霉素在特定波长处的拉曼峰是指硫酸卡那霉素在456cm-1
、536cm-1
处的特征拉曼峰；所述定量分析检测，是指以浓度的对数值为横坐标，即以硫酸卡那霉素浓度的对数为横坐标，以硫酸卡那霉素两个较强的特征峰456cm-1
、536cm-1
处的峰强为纵坐标，建立标准曲线，对硫酸卡那霉素进行定量检测，线性检测范围为100ppm～10ppb，检测限为10ppb，sers强度的相对标准偏差小于10％。
[0033]
实施例1
[0034]
1)合成银纳米粒子
[0035]
合成粒径约55nm的ag纳米粒子：预先配制质量分数1％的柠檬酸钠，配制1mmol/l的agno3溶液，取100ml配置好的agno3溶液于单口圆底烧瓶中，磁力搅拌器搅拌，用电热套加热至沸腾回流状态，加入预先配制好的3ml 1％的柠檬酸钠，加入之后约1min左右，溶液由无色变成乳白，再变成略带绿色的不透明液体。继续搅拌加热微沸1h，再撤离加热套停止加热，自然冷却至室温，再用铝箔纸覆盖圆底烧瓶密封避光保存。
[0036]
2)银纳米粒子的表面等离子体共振吸收谱(spr谱)
[0037]
图1为银纳米粒子加入卡那霉素和盐酸后的表面等离子体共振吸收谱(spr)。从图中可以看出，稀释20倍的银纳米粒子(a)加入1ppm的卡那霉素后，可以看出在414nm处表面等离子体共振吸收强度显著下降，并且在≥650nm波长处均有新的吸收峰产生(b)，当加入盐酸后，在414nm处表面等离子体共振吸收强度下降更低(c)。
[0038]
实施例2
[0039]
1)合成银纳米粒子
[0040]
合成粒径约55nm的ag纳米粒子：预先配制质量分数1％的柠檬酸钠，配制1mmol/l的agno3溶液，取100ml配置好的agno3溶液于单口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器搅拌同时用电热套加热至沸腾回流状态，加入预先配制好的3ml 1％的柠檬酸钠，加入之后约1min左右，溶液由无色变成乳白，再变成略带绿色的不透明液体。继续搅拌加热微沸1h，再撤离加热套停止加热，自然冷却至室温，再用铝箔纸覆盖圆底烧瓶密封避光保存。
[0041]
2)最佳盐酸量的优化
[0042]
确定agnps和100ppb硫酸卡那霉素的加入体积，加入不同体积的盐酸，扫描卡那霉素的表面增强拉曼谱，确定盐酸加入的最佳量比。
[0043]
图2是实施例2的实验结果，即固定agnps与硫酸卡那霉素的浓度(100ppb)，控制它们的体积比，采集sers谱。曲线a～e中，agnps与硫酸卡那霉素和盐酸的体积比分别为1︰1︰1、1︰1︰0.8、1︰1︰0.6、1︰1︰0.4、1︰1︰0.2，1︰0︰0。可以看出，加入不同体积的盐酸后，卡那霉素在456cm-1
和536cm-1
有较强拉曼峰，当加入盐酸量为60μl时，拉曼信号峰达到最强(图2中的曲线c)，随着盐酸加入量逐渐增加大于60μl时(图2中的曲线a和b)，拉曼强度没有增加。因此，后续检测中加入agnps与硫酸卡那霉素和盐酸的体积比固定为1︰1︰0.6。
[0044]
实施例3
[0045]
1)合成银纳米粒子
[0046]
合成粒径约55nm的ag纳米粒子：预先配制质量分数1％的柠檬酸钠，配制1mmol/l的agno3溶液，取100ml配置好的agno3溶液于单口圆底烧瓶中，磁力搅拌器搅拌同时用电热套加热至沸腾回流状态，加入预先配制好的3ml 1％的柠檬酸钠，加入之后约1min左右，溶液由无色变成乳白，再变成略带绿色的不透明液体。继续搅拌加热微沸1h，再撤离加热套停
止加热，自然冷却至室温，再用铝箔纸覆盖圆底烧瓶密封避光保存。
[0047]
2)最佳卡那霉素添加量的优化
[0048]
确定agnps和盐酸的加入体积，通过加入不同体积的硫酸卡那霉素，扫描卡那霉素的表面增强拉曼谱，确定卡那霉素加入的最佳量比。
[0049]
图3是实施例2的实验结果，即固定agnps与硫酸卡那霉素的浓度(100ppb)，控制它们的体积比，采集sers谱。曲线a～e中，agnps与硫酸卡那霉素和盐酸的体积比分别为1︰1.4︰0.6、1︰1︰0.6、1︰0.8︰0.6、1︰0.6︰0.6、1︰0.2︰0.6。可以看出，随着卡那霉素添加量逐渐增大，在456cm-1
和536cm-1
有较强拉曼峰，当卡那霉素的添加量为80μl时(图3中的c)，拉曼信号峰达到最强。但随着卡那霉素添加量超过80μl后，拉曼强度不会随着卡那霉素的添加量增加而增加(图3中的曲线a和b)。因此，后续检测中加入agnps与硫酸卡那霉素和盐酸的体积比固定为1︰0.8︰0.6。
[0050]
实施例4
[0051]
1)合成银纳米粒子
[0052]
合成粒径约55nm的ag纳米粒子：预先配制质量分数1％的柠檬酸钠，配制1mmol/l的agno3溶液，取100ml配置好的agno3溶液于单口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器搅拌同时用电热套加热至沸腾回流状态，加入预先配制好的3ml 1％的柠檬酸钠，加入之后约1min左右，溶液由无色变成乳白，再变成略带绿色的不透明液体。继续搅拌加热微沸1h，再撤离加热套停止加热，自然冷却至室温，再用铝箔纸覆盖圆底烧瓶密封避光保存。
[0053]
2)硫酸卡那霉素的sers检测
[0054]
取100μl的agnps，快速加入80μl 1ppm硫酸卡那霉素和60μl 1mol/l hcl后迅速扫描拉曼光谱，做十次平行，以785nm的激发波长在基底上随机采点，得到不同点对应的卡那霉素表面增强拉曼谱。对比十次平行采集的卡那霉素拉曼峰强度，来确定基底的均一性。
[0055]
取100μl的agnps，快速加入80μl不同浓度硫酸卡那霉素溶液(100ppm、10ppm、1ppm、100ppb、10ppb)和60μl 1mol/l hcl后迅速采集拉曼光谱，对硫酸卡那霉素进行定量检测。
[0056]
图4为十组平行样品采集得到的sers谱图。将agnps和1ppm硫酸卡那霉素以及1mol/l hcl按照1︰0.8︰0.6的比例混合，连续测量十组平行样品，测硫酸卡那霉素的拉曼峰强度，绘制出不同位置点各特征拉曼峰的强度(图4)。由拉曼峰的强度计算出10组平行样品拉曼峰强度的相对标准偏差(rsd)，其值在2.21％～3.39％，均小于10％(见图5)，这说明硫酸卡那霉素在sers基底上重复性较好，可应用于硫酸卡那霉素的表面增强拉曼的定量分析。利用上述基底，测定100ppm～10ppb硫酸卡那霉素(图6)，图6中a～e依次为100ppm、10ppm、1ppm、100ppb、10ppb的硫酸卡那霉素水溶液滴加在sers基底上的拉曼谱图，每个浓度分别做三次平行，硫酸卡那霉素的浓度越大，在456cm-1
和536cm-1
对应的拉曼峰强度越强，两者成正比例关系。以较强的两个峰，456cm-1
和536cm-1
波数处的峰强对数为纵坐标，硫酸卡那霉素浓度的对数为横坐标，绘制两条标准曲线(见图7)，其中，误差棒表示标准偏差，可以看出浓度的对数与拉曼峰强度具有一定的线性关系，线性范围100ppm～10ppb，线性相关系数r2达到0.98785～0.99216，检测限10ppb。该检测限比国标规定的限量标准(约200ppb)，降低1～2个数量级。比液相色谱-串联质谱法检测硫酸卡那霉素的检出限(约20ppb)低。该方法的检测范围在100ppm～10ppb，完全可以满足国标的要求，而且操作简单，
检测成本低，检测速度快。
[0057]
实施例5
[0058]
1)合成银纳米粒子
[0059]
合成粒径约55nm的ag纳米粒子：预先配制质量分数1％的柠檬酸钠，配制1mmol/l的agno3溶液，取100ml配置好的agno3溶液于单口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器搅拌同时用电热套加热至沸腾回流状态，加入预先配制好的3ml 1％的柠檬酸钠，加入之后约1min左右，溶液由无色变成乳白，再变成略带绿色的不透明液体。继续搅拌加热微沸1h，再撤离加热套停止加热，自然冷却至室温，再用铝箔纸覆盖圆底烧瓶密封避光保存。
[0060]
2)牛奶中卡那霉素的加标提取
[0061]
于1.5ml离心管中加入200μl牛奶样品，分别加入100μl不同浓度(1000ppm、100ppm、10ppm、1ppm、100ppb)的硫酸卡那霉素，混匀后加入400ul 1mol/l的盐酸，再加入400ul的亚铁氰化钾溶液(10.6g/l)，混匀后再加入400μl的乙酸锌溶液(22.0g/l)，振荡10s沉淀蛋白，于8000r/min离心2min，转移上清液，取50ul上清液加入450μl水，得到目标分子提取液与基底混合采集拉曼谱图(每个浓度分别测三次)。
[0062]
图8为牛奶中不同浓度硫酸卡那霉素加标提取液的sers谱，从上到下分别为100ppm、10ppm、1ppm、100ppb、10ppb的卡那霉素和空白提取液。由于样品提取液中其它成分(如脂质)的干扰，使测得的拉曼峰强度比等浓度标准溶液拉曼峰弱，检测灵敏度下降。以图7中标准曲线为工作曲线，测得不同浓度硫酸卡那霉素在牛奶中的加标回收结果如表1所示。
[0063]
表1
[0064][0065]
由表1可知，牛奶中样品的加标回收率在89.4％～100.1％，相对标准偏差为1.0％～13％。结果表明，牛奶中硫酸卡那霉素的加标回收率高，检测精密度好，结果可靠，agnps可作为测定硫酸卡那霉素的sers基底。