一种基于寡糖链检测阿尔兹海默症的检测试剂、制备方法及应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种阿尔兹海默症的检测方法，具体涉及一种基于血清寡糖链g-test特异指纹图谱的阿尔兹海默症检测方法。


背景技术：

2.阿尔兹海默症(alzheimer's disease，ad)是发生在老年前期或老年期的一种原发性退行性脑病，是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面出现的障碍，其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(aβ)沉积，神经原纤维缠结，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑的形成，目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的治疗药物。一般阿尔兹海默症经常发生在50岁以后，按照病情的发展，可大致分为三个阶段：第一阶段也称健忘期，这期的表现是记忆力明显减退；第二阶段也称混乱期，这时除第一阶段的症状加重外，很突出的表现是视空间辨认障碍明显加重，很容易迷路；第三阶段也称极度痴呆期，病人进入全面衰退状态，生活不能自理。阿尔兹海默症常无确切起病时间和起病症状，早期往往不易被发现，一旦发生，即呈不可逆的缓慢进展。任何干预措施重在早期识别和诊治，因此早期识别和干预可以减缓认知衰退的过程并有助于减少后续的护理需求，需要积极行动起来防范疾病或者延缓疾病进展。
3.目前，通过采集脑脊液可以用以诊断阿尔兹海默症，但由于是侵入式取样，必须通过腰椎穿刺采集样本，患者的依从性较差。临床上常常使用影像学检查用以辅助诊断阿尔兹海默症，主要有ct、pet、mri、dti等，但是对阿尔兹海默症的敏感度和特异性有待进一步提高。上述诊断方法都有自身的局限性，目前急需探索出用于辅助诊断阿尔兹海默症并具有较高灵敏度和特异度的新型无创性的方法。
4.糖蛋白是通过蛋白质的翻译后修饰即糖基化后形成的一类结合蛋白。蛋白质的糖基化(glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。蛋白质上n-糖链通过加工修饰来调控蛋白质的结构，稳定性和活性，所以糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能起重要作用，从而赋予糖蛋白具有多种生物功能。因此了解糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。
5.研究发现聚糖链末端的唾液酸在调控细胞的相互识别、分子相互作用、病毒感染、免疫响应以及信号传导起到重要的功能，且细胞表面糖蛋白质唾液酸修饰具有组织和细胞特异性。进一步研究发现大脑是体内唾液酸含量最高的器官，以唾液酸化糖脂(神经节苷脂)和糖蛋白(神经细胞粘附分子和突触细胞粘附分子)的形式存在，因此哺乳动物唾液酸酶在中枢神经系统(cns)的发育和功能中发挥着重要的生理作用，唾液酸酶的神经活性依赖性去唾液酸化可能参与海马记忆过程。神经细胞表面活性依赖性去唾液酸化可显著改变
细胞表面特性，并对唾液酸信号依赖性神经活动(如突触可塑性、海马记忆、神经传递、神经细胞粘附和ampa受体转运)提供快速反馈。大脑中糖蛋白的聚糖的唾液酸修饰参与调控大脑的功能，随着人老年龄化和大脑神经的衰退，大脑聚糖唾液酸修饰发生异常改变，由此引起阿尔兹海默症的发生。因此检测唾液酸相关的寡糖基的改变对于疾病的诊断和作为靶点开发治疗的药物具有潜在的临床价值。


技术实现要素：

6.针对目前临床上使用的阿尔兹海默症检测中存在的问题，如血液检查和影像学检测特异性和准确度不高，病理检查有创伤性，患者依存性差等，本发明提供一种阿尔兹海默症检测试剂，通过该试剂测定血清中的天然寡糖n-糖组图谱，再将峰值量化并进行统计学分析，从而提供一种阿尔兹海默症的血清天然寡糖n-糖组图谱模型的建立方法，通过测定生理病理状态下蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测阿尔兹海默症。
7.本发明采用的技术方案如下：
8.一种基于寡糖链检测阿尔兹海默症的检测试剂，由以下试剂组成：
9.试剂a：浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的sds配制而成；
10.试剂b：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液ph值为5～9；
11.试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制成浓度为0.02mm～1m有机物还原剂；
12.试剂d：终止液。
13.优选的，所述试剂a、试剂b与试剂c的体积比是1:1:1。
14.优选的，所述试剂a、试剂b与试剂c的体积都为5μl。
15.优选的，所述试剂d为超纯水。
16.一种基于寡糖链检测阿尔兹海默症的检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
17.步骤一寡糖链的制备
18.在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂a，进行变性，冷却至室温后，加入5μl试剂b，37℃反应3h，然后进行干燥；
19.步骤二寡糖链的标记
20.在步骤一干燥后得到的样品中加入5μl试剂c，60℃反应1h后进行荧光标记，然后加入100μl试剂d终止标记反应；
21.步骤三寡糖链分离分析
22.取10μl寡糖链标记后的液体，用分析仪进行n-寡糖链分离检测，得到天然寡糖n-糖组图谱；
23.步骤四数据处理分析
24.n-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
25.一种组合物在制备寡糖链阿尔兹海默症检测试剂中的应用，所述组合物由血清中的g4s4、g3s3、g2s2、g2s2f、g2s1、g2s1f、g1f和g2f2组成，所述组合物通过(g2s2+g2s2f)/
g2f2的值来检测阿尔兹海默症。
26.所述g1f为同分异构体。
27.本发明提供一种阿尔兹海默症的血清天然寡糖n-糖组图谱模型的建立方法，通过测定血清天然寡糖链g-test特异指纹图谱，进行统计学分析。
28.材料和方法：
29.一、检测样本：阿尔兹海默症患者和健康人的血清。
30.二、实验设备：毛细管电泳分析仪，pcr，离心机。
31.三、试剂制备：
32.1、试剂a：浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的sds配制而成；
33.2、试剂b：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液ph值为5～9；
34.3、试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制成浓度为0.02mm～1m有机物还原剂；
35.4、试剂d：终止液。
36.四、n-糖组图谱检测
37.1、寡糖链的制备
38.在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂a，进行变性；待冷却至室温后，加入5μl试剂b，37℃反应3h，然后进行干燥。
39.2、寡糖链的标记
40.(1)干燥后的样品中加入5μl试剂c，60℃反应1h，进行荧光标记；
41.(2)荧光标记完成后，加入100μl试剂d终止标记反应。
42.3、寡糖链分离分析
43.取10μl寡糖链标记后的液体，在abi3500dx仪器下进行n-寡糖链分离检测，从而得到天然寡糖n-糖组图谱。
44.4、数据处理分析
45.(1)n-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
46.(2)阿尔兹海默症患者与健康人群n-糖组数据分析：将阿尔兹海默症患者与健康人n-糖组数据进行对比分析。将每个峰峰高值除以所有峰高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，即n-糖组图谱的峰值量化，然后对量化后的阿尔兹海默症组和健康对照组n-糖组图谱中9个n-寡糖链峰进行比对统计分析。n-糖组图谱的组合物由g4s4、g3s3、g2s2、g2s2f、g2s1、g2s1f、g1f和g2f2组成，其中g1f为同分异构体，通过组合物(g2s2+g2s2f)/g2f2的值来检测阿尔兹海默症。
47.与现有技术相比，本发明的有益效果：
48.(1)将g-test指纹图谱的各个峰值进行量化，然后将阿尔兹海默症患者(102例)和健康人(109例)各峰相对含量结果进行对比分析，发现n-聚糖组合物g2s2，g2s2f和g2f2在两组间存在显著的统计学差异(p《0.05)；因此，基于组合物(g2s2+g2s2f)/g2f2建立的模型在区分阿尔兹海默症患者时roc曲线下auc值达到0.870，该(g2s2+g2s2f)/g2f2模型检测的
cutoff值为4.98时，对阿尔兹海默症的检测有80.0％的灵敏度和78.6％的特异性，表明血清中的n-聚糖组合物(g2s2+g2s2f)/g2f2可以作为辅助诊断阿尔兹海默症的标志物。
49.(2)本发明提出的g-test检测法是基于dna测序仪的毛细管微电泳技术(dsa-face)，将血清样本中糖蛋白n-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的糖蛋白的含量即天然寡糖n-糖组图谱。本发明通过检测生理病理状态下唾液酸寡糖链的变化与疾病状态的相关性，可以根据这些变化，建立n-聚糖组合物的预测模型来辅助诊断阿尔兹海默症状态。
50.(3)基于本发明方法构建的g-test天然n-糖组图谱模型，能够让众多患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测阿尔兹海默症的发生和疾病进展，本发明的检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(5μl血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等优点，可在临床中推广使用。
附图说明
51.图1是阿尔兹海默症患者和健康人的血清天然寡糖n-糖组图谱；
52.图2是基于n-糖组合物(g2s2+g2s2f)/g2f2建立的鉴别阿尔兹海默症模型roc曲线图；检测样本总数为211例，其中阿尔兹海默症患者血清102例，健康人血清109例，得到roc曲线下面积auc＝0.870。
具体实施方式
53.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件。
54.检测阿尔兹海默症状态，通过测定血清天然寡糖n-糖组图谱，进行统计学分析，采用的材料和方法如下列实施例。
55.实施例一
56.1.检测样本：阿尔兹海默症患者和健康人的血清。
57.2.实验设备：毛细管电泳分析仪，pcr，离心机。
58.3.试剂制备：
59.1)试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度2.5％的sds配制而成。