一种2D回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法

一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法。


背景技术：

2.2d回转器是一种通过地面设备模拟细胞失重效应的重力研究平台，它可以使样品绕垂直于重力场的轴旋转，其旋转速度必须足够快，才能达到这样一种状态：旋转系统不再感知快速旋转的重力矢量，从而达到模拟失重效应的目的。大量研究发现，在模拟微重力条件下的实验与真实微重力条件下的实验结果基本一致或类似，这也支持该回转器实验平台可以作为模拟细胞微重力效应的有效的工具。
3.细胞在回转模拟失重效应后的形态及分子定位是研究空间生物学的重要方法之一。目前，2d回转模拟失重模拟基本采用将细胞接种在2.55
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2.15 cm的方形玻璃片上，回转模拟失重后将玻璃片从回转舱中拿出，再将细胞从玻璃片上刮下进行提蛋白或者rna提取检测等后续操作的流程。如果要做免疫荧光，则需将玻璃片放入6孔板中，按照免疫荧光实验的步骤加入一抗和二抗，最后用荧光显微镜观察，然而这项技术运用在回转模拟失重模型的细胞上有二个明显的缺点。一是浪费抗体，长满细胞的玻璃片放在6孔板中，需要加入至少100μl的一抗和二抗稀释液，由于抗体特别是一抗价格昂贵，按这种方法操作会增加操作费用。如果采用免疫组化笔在玻璃片上画圈可以将抗体围起来，从而节省一部分抗体，但是免疫组化笔画的圈容易脱落，脱落一点就会使抗体稀释液流出来，前功尽弃。二是浪费细胞，在方形玻璃片上做免疫荧光会浪费一整张玻璃片上的细胞，荧光显微镜往往不需要观察那么多细胞，玻璃片周边的细胞会浪费掉，回转模拟失重模型构建操作非常复杂，并且需要非常多的培养基，有些细胞还比较珍贵，所以回转后只做免疫荧光实验有些浪费。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供了一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法，可以在不影响免疫荧光效果和不需要免疫组化笔的前提下尽量减少做免疫荧光时一抗和二抗的使用量，另外方形玻璃片上的除小圆片以外的细胞还可以继续进行免疫印迹或者pcr等检测，节省了珍贵的样本。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法，包括如下步骤：s1、用牙科正畸橡皮圈将直径为14mm的小圆片固定在方形玻璃片上，高压蒸汽灭菌后，按照原方法将细胞接种至方形玻璃片上，放入回转舱固定架上，进行回转模拟失重实验；s2、回转完成后，将方形玻璃片取出，取下小圆片进行细胞免疫荧光实验，孵育一抗时，将保鲜膜贴在24孔板的盖子的背面，然后在盖子上滴30μl的一抗，将有小圆片有细胞的一面倒扣在液滴上，即可；二抗孵育时使用相同的办法。
6.进一步地，洗涤一抗或者二抗时，将小圆片放在24孔板中进行洗涤。
7.进一步地，直径为14mm的小圆片固定在方形玻璃片的中心位置，牙科正畸橡皮圈套设在小圆片和方形玻璃片外。
8.采用本发明的方法做免疫荧光效果与传统方法比较效果无差别，本发明的方法具有以下有益效果：1）可以大幅减少细胞免疫荧光操作过程中一抗和二抗的使用量，每个小圆片只需要用30μl左右的一抗稀释液和二抗稀释液。
9.2）除去小圆片的细胞做免疫荧光外，方形玻璃片上的其他细胞可以继续提蛋白、rna或者其他实验，对于比较珍贵的细胞样本来说避免了样本的浪费，充分利用了样本。
附图说明
10.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为将小圆片固定在方形玻璃片上的结构示意图。
11.图2为本发明实施例中采用本方法和传统方法对原代人脐静脉内皮细胞的hsp60分子染色的示意图。
具体实施方式
12.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
13.实施例1一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法，包括如下步骤：s1、如图1所示，用牙科正畸橡皮圈3将直径为14mm的小圆片1固定在方形玻璃片2上，高压蒸汽灭菌后，按照原方法将细胞接种至方形玻璃片上，放入回转舱固定架上，进行回转模拟失重实验；具体地，直径为14mm的小圆片固定在方形玻璃片的中心位置，牙科正畸橡皮圈套设在小圆片和方形玻璃片外，高压蒸汽灭菌后，将细胞按1
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105个/片的密度，接种于方形玻璃片上，放在六孔板里过夜培养。用ecm完全培养基将回转舱灌满并预热24 h，待细胞在方形玻璃片上生长至50％左右后，将长有细胞的玻片插入回转舱内的不锈钢支架的卡槽内，排尽气泡后放到回转器的旋臂上，以24 r/min的转速在37℃恒温箱中旋转培养。
14.s2、回转完成后，将方形玻璃片取出，取下小圆片进行细胞免疫荧光实验，孵育一抗时，将保鲜膜贴在24孔板的盖子的背面，然后在盖子上滴30μl的一抗，将有小圆片有细胞的一面倒扣在液滴上，即可；二抗孵育时使用相同的办法。其中，洗涤一抗或者二抗时，将小圆片放在24孔板中进行洗涤。
15.如图2所示，采用本方法和传统方法对原代人脐静脉内皮细胞的hsp60分子染色，染色效果无差别。
16.以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影
响本发明的实质内容。


技术特征：
1.一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法，其特征在于：包括如下步骤：s1、用牙科正畸橡皮圈将直径为14mm的小圆片固定在方形玻璃片上，高压蒸汽灭菌后，按照原方法将细胞接种至方形玻璃片上，放入回转舱固定架上，进行回转模拟失重实验；s2、回转完成后，将方形玻璃片取出，取下小圆片进行细胞免疫荧光实验，孵育一抗时，将保鲜膜贴在24孔板的盖子的背面，然后在盖子上滴30μl的一抗，将有小圆片有细胞的一面倒扣在液滴上，即可；二抗孵育时使用相同的办法。2.如权利要求1所述的一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法，其特征在于：洗涤一抗或者二抗时，将小圆片放在24孔板中进行洗涤。3.如权利要求1所述的一种2d回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法，其特征在于：直径为14mm的小圆片固定在方形玻璃片的中心位置，牙科正畸橡皮圈套设在小圆片和方形玻璃片外。

技术总结
本发明公开了一种2D回转细胞模拟失重模型下的细胞免疫荧光操作方法，包括如下步骤：用牙科正畸橡皮圈将直径为14mm的小圆片固定在方形玻璃片上，高压蒸汽灭菌后，按照原方法将细胞接种至方形玻璃片上，放入回转舱固定架上，进行回转模拟失重实验；回转完成后，将方形玻璃片取出，取下小圆片进行细胞免疫荧光实验，孵育一抗时，将保鲜膜贴在24孔板的盖子的背面，然后在盖子上滴30μL的一抗，将有小圆片有细胞的一面倒扣在液滴上，即可；二抗孵育时使用相同的办法。本发明可以在不影响免疫荧光效果和不需要免疫组化笔的前提下尽量减少做免疫荧光时一抗和二抗的使用量，且样本能充分利用。利用。利用。


技术研发人员：李程飞 王媛 赵星成 张思琦 潘益凯 李曦
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2022.11.18
技术公布日：2023/3/17