一种用于AlphaLISA检测的冻干保护剂组合物及其制备方法

本发明属于医药领域，具体涉及一种用于alphalisa检测的冻干保护剂组合物及其制备方法。

背景技术：

1、alphalisa(amplified luminescent proximity homogeneous assay linkedimmunosorbent assay)检测方法，不需要洗涤，操作简便，灵敏度高，动态范围宽(3-4个数量级)，亲和范围大(高低亲和力的抗体均可应用)，抗干扰能力强，可用于替换传统的elisa检测方法。目前alphalisa检测方法已被成功地应用于酶检测、相互作用检测(包括受体/配体、蛋白/蛋白、蛋白/dna等)、免疫检测、gpcr功能检测(camp，ip3)等热点领域。目前商业化试剂盒均为液态试剂，alphalisa检测体系中含有抗体、生物素和链霉亲和素等蛋白成分需要在低温条件下保存，使用时需要恢复室温，不仅操作繁琐，而且alphalisa反应对温度比较敏感，实验温度差异会导致信号值波动，进而影响试剂的重复性。另外，低温保存也会增加储存、运输方面的成本以及能耗。

2、冷冻干燥技术是生物制品科研和生产中保存蛋白质最为常用的技术。它既可以保持产品的生物学特性，又能延长生物制品在常温保存的有效期。冷冻干燥是利用冰晶升华的原理，在高度真空的环境下，将已冻结了的生物制品的水分不经过冰的融化直接从冰固体升华为蒸汽。冷冻干燥技术具有较多的优点，干燥后的生物制品的生物学活性和体积保持不变，排除了95％～99％以上的水分，能够长期保存而不变质，冻干形成的疏松多孔结构，极易吸水恢复原状。因此极其适合应用于免疫检测试剂的研发，既有利于试剂的储存和运输，也不影响试剂的检测。但常规冷冻干燥技术，预冻时间比较长，而alphalisa检测体系的供体球和受体球的稳定性在长时间冷冻时易受破坏，导致常规冷冻干燥不适宜alphalisa体系。

3、而与常规的冻干相比，液氮速冻，具有预冻时间快的优势，减少了检测试剂暴露在常温环境的时间。除此之外，液氮冻干还可形成冻干珠小球，具有节省冻干空间(不需要将试剂条等包装一起放入冻干机进行冻干，提高了冻干机的利用率)、方便转移(一人份试剂一个小球，前期研发和小批量生产时，可以通过人工手动来分装小球；产能提升后，可通过自动化设备进行自动化分装)、复溶迅速(冻干珠小球没有与管壁的接触面，整个球形体都是疏松网状结构)等优点。但是冻干珠小球同时也具备易破碎等特性，因此需要找到一种alphalisa检测试剂所需的冻干保护体系，制备出更易长期保存的完整、圆滑、不易破碎的冻干珠小球。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于alphalisa检测的冻干保护剂组合物及其制备方法。

2、本发明所提供的用于alphalisa检测的冻干保护剂组合物包括alphalisa检测试剂和冻干保护剂，

3、所述alphalisa检测试剂包括用于alphalisa反应的检测试剂a和检测试剂b，其中检测试剂a包括生物素化抗体、抗体标记受体球和稀释液，检测试剂b包括链霉亲和素偶联供体微球和稀释液；

4、具体地，所述检测试剂a的组成为：0.05-1.0μg/ml的生物素化抗体、5-50μg/ml的抗体标记受体球和稀释液，其中，所述稀释液的组成为：50mm磷酸缓冲液，ph7.4，50mm氯化钠，2mm二乙基三胺五乙酸，1mg/ml葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％tween-20，0.01％proclin300；

5、所述检测试剂b的组成为：5-50μg/ml的链霉亲和素偶联供体微球和稀释液，其中，所述稀释液的组成为：50mm磷酸缓冲液，ph7.4，50mm氯化钠，2mm二乙基三胺五乙酸，1mg/ml葡聚糖500,0.5％牛血清白蛋白，0.1％tween-20，0.01％proclin300。

6、所述冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种的复合物：葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、酪蛋白。

7、所述冻干保护剂与alphalisa检测试剂的重量体积比浓度为1％-10％，即每100mlalphalisa检测试剂中含有1-10g冻干保护剂。

8、具体地，每100ml检测试剂a中含有1-10g冻干保护剂，且每100ml检测试剂b中也含有1-10g冻干保护剂；

9、更具体地，每100ml检测试剂a或b中含有1-10g的蔗糖、葡聚糖、海藻糖中的至少一种和1-5g的牛血清白蛋白和/或酪蛋白。

10、在本发明的实施方式中，每100ml检测试剂a中含有5g蔗糖和2g牛血清白蛋白(bsa)；每100ml检测试剂b中含有5g蔗糖和2g牛血清白蛋白(bsa)。

11、通过大量的实验研究发现，该冻干保护剂可使得冻干试剂形态较好，试剂性能较好且可长期稳定储存。

12、所述alphalisa检测试剂为冻干珠小球，稳定性好。

13、本发明还提供上述用于alphalisa检测的冻干保护剂组合物的制备方法。

14、本发明所提供的用于alphalisa检测的冻干保护剂组合物的制备方法，包括如下步骤：

15、1)将生物素化抗体和抗体标记受体球用稀释液分别稀释至所需浓度，将所得两种溶液混合得到检测试剂a；加入冻干保护剂，混匀，得到含冻干保护剂的检测试剂a；转移至滴珠机中，使试剂在液氮中速冻形成冰球，将带有液氮的速冻试剂球真空干燥，得到检测试剂a冻干珠小球；

16、2)将链霉亲和素偶联供体微球用稀释液稀释至所需浓度得到检测试剂b；加入冻干保护剂，混匀，得到含冻干保护剂的检测试剂b；转移至滴珠机中，使试剂在液氮中速冻形成冰球，将带有液氮的速冻试剂球真空干燥，得到检测试剂b冻干珠小球，即可。

17、上述方法步骤1)、2)中，设置滴珠体积为10-20μl/滴，具体可为20μl/滴；

18、液氮速冻后真空干燥的条件如下：

19、1)预冻阶段：液氮1-10min，压强为1atm；

20、2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0pa，维持1-2h；

21、3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0pa，维持3-5h；

22、4)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0pa，维持1-2h；

23、5)升华阶段：控制温度-20℃～-10℃，压强0.1-2.0pa，维持1-2h；

24、6)解析阶段：控制温度0℃～10℃，压强0.1-2.0pa，维持2-4h；

25、7)解析阶段：控制温度10℃～20℃，压强0.1-2.0pa，维持2-4h。

26、在本发明的实施方式中，液氮速冻后真空干燥的条件如下：

27、1)预冻阶段：液氮1-10min，压强为1atm；

28、2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0pa，维持1h；

29、3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0pa，维持4h；

30、4)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0pa，维持1h；

31、5)升华阶段：控制温度-20℃～-10℃，压强0.1-2.0pa，维持1h；

32、6)解析阶段：控制温度0℃～10℃，压强0.1-2.0pa，维持3h；

33、7)解析阶段：控制温度10℃～20℃，压强0.1-2.0pa，维持3h。

34、通过大量的实验研究发现，采用上述液氮速冻干燥处理，冻干后的试剂呈小球状，圆形效果好，形状及体积均匀，大小一致，水分含量低，可以长时间稳定储存，不影响检测信号值，且相较常规冻干处理用时更短。