一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法

本发明属于基因工程技术，具体地说，涉及一种特异性多克隆抗体检测cog5的间接elisa方法。

背景技术：

1、心血管疾病是当代社会致死率较高的疾病之一，显著高于恶性肿瘤和其他疾病，是威胁人类生命安全和身体健康的首要杀手。研究显示，血脂异常是as形成的核心因素。高尔基体是脂类和蛋白质转运/分选的中心枢纽，也是蛋白质和脂类糖基化的主要部位。据报道，保守寡聚高尔基体(cog)复合物位于高尔基体的膜质表面，由八个亚基组成(cog1-cog8)，分布在两个叶中。其中，cog5在稳定高尔基体的结构和功能方面起着重要作用，并且可以影响细胞内膜运输。既往研究发现，敲低cog5会导致导致细胞内ldlr积聚。进一步研究发现，在人类动脉粥样硬化斑块中，cog5表达与动脉粥样硬化斑块中ldlr表达负相关。因此，cog5与冠状动脉粥样硬化密切相关。

2、因此，我们推断在动脉粥样硬化性心血管病的疾病进程中，cog5有可能从冠状动脉粥样硬化斑块释放入血。那么能否运用一种检测方法，通过检测血清中cog5浓度判断冠状动脉有无狭窄及狭窄程度？将基础研究转化为临床诊断应用。

3、目前，关于cog5的基础研究较多，国内外仍没有血清cog5检测的参考方法，各实验室的检测结果也没有可比性，更无法投入临床应用。因此，有必要提供一种新的特异性多克隆抗体检测cog5的间接elisa方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种特异性多克隆抗体检测cog5的间接elisa方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种特异性多克隆抗体检测cog5的间接elisa方法，包括以下步骤：

3、(1)包被∶使用包被液将cog5重组蛋白，在96孔板上进行100μl/孔包被；

4、(2)洗板：第二天倒掉板孔内包被液，用pbst洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干；

5、(3)封闭∶使用封闭剂对包被后的酶标板进行封闭处理，每孔加200μl，条件37℃温浴1h；

6、(4)洗板：倒掉板孔内封闭液，用pbst洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干；

7、(5)加入一抗免疫血清∶用pbst将多抗血清倍比稀释，同时设空白对照和阴性对照，每孔100μl，加完后，于37℃温箱孵育1h；

8、(6)洗板：倒掉板孔内免疫血清，用pbst洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干；

9、(7)加酶标二抗∶上述一抗孵育结束并洗涤后，用pbst将酶标二抗稀释为1∶10000稀释度，每孔100μl，37℃避光温箱孵育1h，洗板；

10、(8)加入双组份显色液a，b每孔各50μl，置于恒温水浴箱中，全程避光操作，37℃温浴1-15min不等；

11、(9)终止液每孔加100μl，终止显色反应；

12、(10)用thermo酶标仪在450-630nm进行双波长od值检测。

13、可选地，所述的cog5重组蛋白抗原的氨基酸序列如seq id no.1所示。

14、可选地，所述步骤(1)的cog5重组蛋白的浓度为0.0514ng/ml～11.1111ng/ml。

15、可选地，所述步骤(1)的包被液与cog5重组蛋白抗原按1∶10进行稀释；包被条件为37℃，1小时，然后放4℃冰箱，24小时过夜。

16、可选地，所述步骤(3)的封闭剂为1％bsa。

17、可选地，所述步骤(5)的用pbst将抗血清稀释度为1∶5000。

18、可选地，所述步骤(7)的酶标二抗为加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，酶标二抗的稀释度为1∶10000。

19、可选地，所述步骤(8)中的双组份显色液a，b分别为tmb双组分显色液pr1210-100ml。

20、可选地，所述步骤(9)中的显色反应为3min。

21、可选地，所述步骤(10)的终止液为c1058。

22、与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

23、以cog5特异性多克隆抗体为基础，建立了一种特异性多克隆抗体检测cog5的间接elisa方法。该方法测定血清cog5具有良好的检测性能，可初步满足临床需求。cog5作为判断有无冠脉粥样硬化斑块的指标有较好的诊断效能。

24、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

技术特征：

1.一种特异性多克隆抗体检测 cog5 的间接elisa方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述的cog5 重组蛋白抗原的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（1）的cog5 重组蛋白的浓度为 0.0514 ng/ml～11.1111 ng/ml。

4.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（1）的包被液与cog5重组蛋白抗原按 1∶10 进行稀释；包被条件为37℃，1小时，然后放4℃冰箱，24小时过夜。

5.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（3）的封闭剂为1%bsa。

6.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（5）的用pbst将抗血清稀释度为1∶5000。

7.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（7）的酶标二抗为加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，酶标二抗的稀释度为1∶10000 。

8.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（8）中的双组份显色液a，b分别为tmb双组分显色液pr1210-100ml。

9.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（9）中的显色反应为3min。

10.根据权利要求1所述的间接elisa方法，其特征在于，所述步骤（10）的终止液为c1058。

技术总结
本发明公开了一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法，包括以下步骤：使用包被液将COG5重组蛋白进行包被；第二天倒掉板孔内包被液，用PBST洗涤；使用封闭剂对包被后的酶标板进行封闭处理；倒掉封闭液，用PBST洗涤；用PBST将多抗血清倍比稀释，同时设空白对照和阴性对照，温箱孵育；倒掉免疫血清，用PBST洗涤；用PBST将酶标二抗稀释，箱孵育，洗板；加入双组份显色液A，B温浴；加入终止液，终止显色反应；进行双波长OD值检测。该方法测定血清COG5具有良好的检测性能，可初步满足临床需求。

技术研发人员：段勇,董程,熊秋霞,王潇,洪源,华木星
受保护的技术使用者：昆明医科大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15