一种测定陈醋中川芎嗪含量的方法与流程

1.本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种测定陈醋中川芎嗪含量的方法。


背景技术：

2.陈醋是食醋的一种，其醋含水分少，色浓、味香绵，且能长期贮存，故名陈醋。其中，以山西陈醋最为出名，不但是调味佳品，更可供药用，对高血压、肝炎、皮肤病也具有一定疗效和预防作用。
3.山西陈醋在陈酿过程会逐渐产生川芎嗪，川芎嗪是山西老陈醋的两个特征性指标之一。当山西陈醋经一定时间陈酿，其川芎嗪含量逐渐升高，当其符合gb/t 19777-2013《地理标志性产品山西老陈醋》要求时，即其含量在山西老陈醋中不得低于30mg/l，可称作山西老陈醋。
4.目前gb/t 19777-2013《地理标志性产品山西老陈醋》在附录b中也规定了川芎嗪含量的检测方法，但该检测方法中存在以下问题：
5.1)色谱柱使用柱长150mm
×
柱孔径6.0mm等非常规色谱柱，缺少通用性等，目前通用的一般色谱柱为柱长150mm或250mm
×
柱孔径为4.6mm；
6.2)川芎嗪是碱性化合物，在该检测方法下使用通用的一般色谱柱会出现色谱峰拖尾的现象，导致峰宽w变大，理论板数n变小；
7.3)该检测方法的样品提取操作复杂，消耗时间长，使用三氯甲烷等高毒性试剂，有不易重现、回收率低等的缺点。
8.有鉴于此，确有必要提供一种解决上述技术问题的技术方案。


技术实现要素：

9.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种测定陈醋中川芎嗪含量的方法，以解决目前gb/t 19777-2013检测方法采用的色谱柱通用性差的缺点，通过重建色谱条件，克服色谱柱缺少通用性的缺点。
10.本发明的目的采用以下技术方案实现：
11.一种测定陈醋中川芎嗪含量的方法，包括以下步骤：
12.采用反相高效液相色谱法对经过酸处理的陈醋混合液进行色谱检测；色谱检测条件为：色谱柱的柱温为30～40℃；流动相为磷酸盐溶液-醇的体系，磷酸盐溶液的浓度为0.01～0.03mol/l，磷酸盐溶液与醇的体积比为(58～62):(38～42)；流速为0.8～1.2ml/min；
13.根据检测的结果计算陈醋中川芎嗪的含量。
14.优选的，酸处理采用的酸为盐酸，处理步骤为：将盐酸与陈醋混合均匀，离心，取上清液，过滤，取滤液定容，得陈醋混合液。
15.优选的，盐酸与陈醋的体积比为(0.9～1.1):1；盐酸的浓度为0.1～0.3mol/l；离心的转速为3500～4500r/min，离心时间为10～20min；过滤采用的滤膜为0.4～0.5μm水性
滤膜。
16.优选的，检测的出峰时间为9.5～14.5min，理论板数为5500～16000，拖尾因子为1.100～1.550。
17.优选的，色谱柱为经过表面带电杂化且颗粒为5μm的c
18
色谱柱，尺寸为柱长250mm
×
柱孔径4.6mm。
18.优选的，色谱检测条件为：色谱柱的柱温为35℃；流动相为磷酸盐溶液-甲醇的体系，磷酸盐溶液的浓度为0.02mol/l，磷酸盐溶液与醇的体积比为60:40；流速为1ml/min；进样体积为10μl；紫外的检测波长为279nm。
19.优选的，检测的出峰时间为9.5～10.5min，理论板数为10000～16000，拖尾因子为1.100～1.350。
20.优选的，陈醋中川芎嗪含量的计算方法为：
21.配置盐酸川芎嗪标准贮备液，在3～5℃下密封保存5～7个月，然后分别称取不同体积的盐酸川芎嗪标准贮备液，分别配置成不同浓度的盐酸川芎嗪标准工作液，在与陈醋同样处理的色谱条件下，采用反相高效液相色谱法分别进行检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制盐酸川芎嗪的标准曲线或求得线性回归方程；
22.将陈醋混合液的检测结果对应盐酸川芎嗪的标准曲线或线性回归方程，求得陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度；
23.再根据公式计算陈醋中川芎嗪的含量，
24.公式为：其中，
25.x为陈醋中川芎嗪的含量，mg/l；
26.c为陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度，mg/l；
27.v为陈醋混合液的体积，ml；
28.m为反相高效液相色谱法中陈醋混合液的取样量，ml。
29.优选的，陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度c的范围为5～100mg/l，线性回归方程的相关系数≥0.999。
30.优选的，分离度≥3，加标回收率为95％～105％，独立测定重复性偏差≤10％。
31.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的陈醋中川芎嗪含量的测定方法，根据色谱柱和川芎嗪的特点，先采用酸对陈醋进行前处理，通过酸离子化使川芎嗪在样品溶液溶解性更稳定，然后重新构建色谱条件，保持在柱温为30～40℃，流动相中的磷酸盐溶液的浓度为0.01～0.03mol/l，磷酸盐溶液与醇的体积比为(58～62):(38～42)，流速为0.8～1.2ml/min下进行，可通用常规的色谱柱(柱长150mm或250mm
×
柱孔径为4.6mm)，且测量结果相比于gb/t 19777-2013检测方法更准确，检测效率更高。
附图说明
32.图1为本发明色谱条件下采用waters hss t3 250mm
×
4.6mm
×
5μm c
18
色谱柱的色谱测试图。
33.图2为本发明色谱条件下采用intersil ods-3 250mm
×
4.6mm
×
5μm c
18
色谱柱的色谱测试图。
34.图3为本发明色谱条件下采用waters xselect csh 250mm
×
4.6mm
×
5μm c
18
色谱柱的色谱测试图。
35.图4为本发明色谱条件下45mg/l盐酸川芎嗪标准溶液的标准色谱图。
36.图5为本发明色谱条件下本底浓度为30mg/l的山西老陈醋的样品色谱图。
37.图6为本发明色谱条件下本底浓度30mg/l+加标45mg/l的山西老陈醋加标的样品色谱图。
具体实施方式
38.下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.本发明旨在提供一种测定陈醋中川芎嗪含量的方法，包括以下步骤：
40.采用反相高效液相色谱法对经过酸处理的陈醋混合液进行色谱检测；色谱检测条件为：色谱柱的柱温为30～40℃；流动相为磷酸盐溶液-醇的体系，磷酸盐溶液的浓度为0.01～0.03mol/l，磷酸盐溶液与醇的体积比为(58～62):(38～42)；流速为0.8～1.2ml/min；
41.根据检测的结果计算陈醋中川芎嗪的含量。
42.目前gb/t 19777-2013检测方法中提供的前处理方法为，采用三氯甲烷对陈醋进行多次萃取，将萃取得到的三氯甲烷层进行合并，然后再采用盐酸多次反萃取三氯甲烷相，得到的水相进行合并，过滤定容后备用。此种复杂的处理过程为了考虑去除大量的有机质(杂质)的问题，造成了川芎嗪提取的损失，导致测定结果准确性下降。
43.而本发明提供的测定方法，反相高效液相色谱法的检测对象为只经过酸处理的陈醋混合液，不需要三氯甲烷的多次萃取、盐酸的多次反萃取，大大优化了前处理过程，提高了处理效率。虽相比于国标，本发明在前处理过程中没有通过多次萃取、反萃取去除有机质，但通过测定结果验证，本发明提供的测定方法并未出现有机质对川芎嗪造成干扰，影响测定结果的问题；反而因优化了前处理过程，大大避免了川芎嗪提取的损失，结合本发明特定条件下的色谱条件进行配合使用，该色谱条件中川芎嗪易与有机质分离，测定的结果相比于国标准确性更高。
44.其中，本发明控制的色谱柱的柱温为30～40℃，优选的为35℃。相比于直接在室温下进行，本发明在反相高效液相色谱易控制温度的稳定性，实现柱温的恒定控制；同时采用的温度不超过40℃，不会由于过高的柱温导致待测物在测试过程中分解的问题，特别是在35℃下进行检测，更保证了川芎嗪含量测定结果的准确性。
45.另外，本发明还采用浓度为0.01～0.03mol/l的磷酸盐溶液作为流动相组成之一，优选的，磷酸盐溶液的浓度为0.02mol/l。相比于国标采用的浓度，本发明的浓度接近是国标的100倍，该浓度与醇组成的流动相，溶液的离子浓度升高，能有效起到缓冲作用，此外，还采用体积比为(58～62):(38～42)的磷酸盐溶液：醇，有机相的比例升高，更有利于缩短有机杂质和川芎嗪的洗脱时间。优选的，该磷酸盐溶液为磷酸二氢铵溶液。
46.同时，还匹配0.8～1.2ml/min的流速，优选的为1.0ml/min，与其他色谱条件联用，
重建了色谱检测条件，由此保证了本发明测定方法对于色谱柱的通用性和测定结果的准确性。一般地，流速影响洗脱时间和理论板数，流速越小，峰展宽越大，理论板数也小。
47.在一些实施方式中，酸处理采用的酸为盐酸，处理步骤为：将盐酸与陈醋混合均匀，离心，取上清液，过滤，取滤液定容，得陈醋混合液。
48.与国标中前处理所采用的盐酸不同的是，本发明采用盐酸作为酸处理，是因为发现盐酸离子化可使川芎嗪在水样品溶液溶解性更稳定，而非是作为反萃取剂。这主要是因为川芎嗪是一种中药活性生物碱，含有碱性基团，其虽也能溶于热水、石油醚、氯仿等多种溶剂，但在本发明的测定方法中发现稀盐酸的测定结果更好。
49.另外，酸处理中，通过离心也可沉淀至少一部分变形蛋白质和溶液ph改变后的不溶解有机物，也达到了减少部分有机质的目的，但总体上而言，相比于去除杂质带来的川芎嗪损失，有机质的存在在本发明的测定方法中并不会对川芎嗪的测定结果产生多大的影响。
50.在一些实施方式中，盐酸与陈醋的体积比为(0.9～1.1):1；盐酸的浓度为0.1～0.3mol/l；离心的转速为3500～4500r/min，离心时间为10～20min；过滤采用的滤膜为0.4～0.5μm水性滤膜。
51.优选的，盐酸与陈醋的体积比为1:1；盐酸的浓度为0.2mol/l；离心的转速为4000r/min，离心时间为15min；过滤采用的滤膜为0.45μm水性滤膜。
52.具体的，酸处理步骤可为：取陈醋样品5ml，置15ml离心管(pp材质)中，用0.2mol/l的盐酸溶液定容至10ml，摇匀；在4000r/min下离心15min，取上清液，过0.45μm水性滤膜，取滤液定容至10ml，得陈醋混合液，而后可根据色谱的进样量去取样再测定。
53.在一些实施方式中，检测的出峰时间为9.5～14.5min，理论板数为5500～16000，拖尾因子为1.100～1.550。
54.在一些实施方式中，检测的出峰时间为9.5～10.5min，理论板数为10000～16000，拖尾因子为1.100～1.350。
55.需要说明的是，在液相色谱中，目标物保留时间越短，分析所需时间越短，即是出峰时间越短；理论板数越高，峰形越尖锐，越容易与其他物质分离；拖尾因子越接近1，峰形越对称，更容易与其他峰分离。在本发明优选的色谱条件下，色谱的检测出峰时间能缩短至9.5～10min，理论板数达到15000～16000，拖尾因子为1.100～1.250，更接近1。
56.在一些实施方式中，色谱柱为经过表面带电杂化且颗粒为5μm的c
18
色谱柱(十八烷基键合硅胶颗粒填充柱)，尺寸为柱长250mm
×
柱孔径4.6mm，称为csh 250mm
×
4.6mm
×
5μm c
18
柱色谱柱。该尺寸的色谱柱为通用色谱柱，本发明的测定方法适用性更强。
57.其中，表面带电杂化(csh)颗粒是基于亚乙基桥杂化(beh)颗粒技术，表面带有少量电荷，可改善低离子强度流动相中的上样能力和峰不对称性的问题，同时保持beh颗粒技术固有的机械和化学稳定性。本发明采用该色谱柱结合特定的色谱条件能有效改善川芎嗪在色谱分离中拖尾的现象，有效实现色谱分离，相比于其他的色谱柱具有更快出峰时间、更高理论板数、更小拖尾因子的优点。
58.在一些实施方式中，色谱检测条件为：色谱柱的柱温为35℃；流动相为磷酸盐溶液-甲醇的体系，磷酸盐溶液的浓度为0.02mol/l，磷酸盐溶液与醇的体积比为60:40；流速为1ml/min；进样体积为10μl；紫外的检测波长为279nm。
59.本发明采用的反相高效液相色谱法(hplc)，相比于uhplc法，虽然uhplc分析时间更短，使用的色谱柱柱效更高(因为柱长短，柱孔径更小，填料颗粒更小，柱载量小)，进样量更小(2μl)，但其系统压力也会更高，仪器设备和耗材成本也会更高。
60.使用不同的色谱柱在其他色谱条件相同情况下验证各个色谱柱的效果，
61.1)使用waters hss t3 250mm
×
4.6mm
×
5μm(柱长
×
孔径
×
颗粒大小)c
18
色谱柱，测试结果见图1所示，其保留时间＝14.217min，理论板数＝7999，拖尾因子＝1.504；
62.2)使用intersil ods-3 250mm
×
4.6mm
×
5μm(柱长
×
孔径
×
颗粒大小)c
18
色谱柱，测试结果见图2所示，其保留时间＝13.739min，理论板数＝5975(有分裂峰倾向)，拖尾因子＝1.388；
63.3)使用waters xselect csh 250mm
×
4.6mm
×
5μm(柱长
×
孔径
×
颗粒大小)c
18
柱色谱柱，测试结果见图3所示，保留时间＝9.854min，理论板数＝15175，拖尾因子＝1.243。
64.可见，优选使用waters xselect csh 250mm
×
4.6mm
×
5μm c
18
柱色谱柱。这主要是因为川芎嗪是一种碱性有机化合物，在国标的测定方法中c
18
柱洗脱过程容易发生拖尾效应，而采用本发明的测定方法，该优选的c
18
柱能有效缓解川芎嗪在色谱分离中拖尾现象，有效实现色谱分离。
65.采用waters xselect csh 250mm
×
4.6mm
×
5μm c
18
柱色谱柱，在本发明范围内的相同色谱条件下，以本底浓度为30mg/l继续验证本发明的前处理效果，色谱结果见图4～6，其中，图4为45mg/l盐酸川芎嗪标准溶液的标准色谱图；图5为本底浓度为30mg/l的山西老陈醋的样品色谱图；图6为本底浓度30mg/l+加标45mg/l的山西老陈醋加标的样品色谱图。计算加标回收率，加标回收率＝(加标样品实测浓度-样品本底实测浓度)/加标浓度
×
100％，本发明的范围在95％～105％之间，满足gb/t 27404-2008的要求，可见本发明的前处理方法并没有因为杂质有机质而影响川芎嗪的测定结果。
66.另外，利用本发明的测定方法，测试的分离度可以达到3以上，且独立测定重复性偏差≤10％，进一步证明了本发明的前处理方法并没有因为有机质的存在而影响了侧测定的结果。一般地，分离度≥1.5时，即是测定项与其他物质分离开，不受杂质的干扰。
67.在一些实施方式中，陈醋中川芎嗪含量的计算方法为：
68.配置盐酸川芎嗪标准贮备液，在3～5℃下密封保存5～7个月，然后分别称取不同体积的盐酸川芎嗪标准贮备液，分别配置成不同浓度的盐酸川芎嗪标准工作液，在与陈醋同样处理的色谱条件下，采用反相高效液相色谱法分别进行检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制盐酸川芎嗪的标准曲线或求得线性回归方程；
69.将陈醋混合液的检测结果对应盐酸川芎嗪的标准曲线或线性回归方程，求得陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度；
70.再根据公式计算陈醋中川芎嗪的含量，
71.公式为：其中，
72.x为陈醋中川芎嗪的含量，mg/l；
73.c为陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度，mg/l；
74.v为陈醋混合液的体积，ml；
75.m为反相高效液相色谱法中陈醋混合液的取样量，ml。
76.在一些实施方式中，陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度c的范围为5～100mg/l，线性回归方程的相关系数≥0.999。
77.下面，以具体的实施例进行说明。
78.实施例1
79.一种测定陈醋中川芎嗪含量的方法，包括以下步骤：
80.前处理：取陈醋样品5ml，置15ml离心管(pp材质)中，用0.2mol/l的盐酸溶液定容至10ml，摇匀；在4000r/min下离心15min，取上清液，过0.45μm水性滤膜，取滤液定容至10ml，得陈醋混合液，
81.盐酸川芎嗪标准系列工作液的配置及检测：准确称取31.7mg盐酸川芎嗪(以纯品计算，盐酸川芎嗪按分子量折算川芎嗪系数为0.7888)于25ml容量瓶，用水定容至刻度，摇匀，得浓度为1000mg/l的盐酸川芎嗪标准贮备液(以川芎嗪计)，在4℃密封保存6个月；分别取盐酸川芎嗪标准贮备液(1000mg/l，以川芎嗪计)0.25ml、0.10ml、0.25ml、0.50ml、1.00ml，用水定容至50ml、10ml、10ml、10ml、10ml(分别相当于浓度为5mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l)，得盐酸川芎嗪标准系列工作液；然后在与陈醋同样处理的色谱条件下，采用反相高效液相色谱法分别进行检测，以质量浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标；绘制盐酸川芎嗪的标准曲线或求得线性回归方程，回归方程y＝31533x-9204，相关系数r＝0.9999，线性范围为在5～100mg/l均呈良好线性；
82.陈醋混合液的色谱测定：色谱条件为：
83.a.色谱柱：waters xselect csh c18 250mm
×
4.6mm
×
5μm；
84.b.柱温：35℃；
85.c.流动相：0.02mol/l磷酸二氢铵溶液-甲醇(60:40，体积比)；
86.d.流速：1.0ml/min；
87.e.进样体积：10μl；
88.f.检测波长：279nm；
89.g.检测仪器：岛津lc-15c，紫外检测器；
90.其中，0.02mol/l磷酸二氢铵溶液的配置方法为：取磷酸二氢铵(分析纯或色谱纯)2.3g，加超纯水溶解并定容至1000ml，过0.45μm滤膜，得0.02mol/l磷酸二氢铵溶液；甲醇为hplc级甲醇；流动相以0.02mol/l磷酸二氢铵溶液+甲醇(体积比为60：40)混合均匀，脱气后使用单泵洗脱；或双泵分别使用0.02mol/l磷酸二氢铵溶液、甲醇按60：40比例等梯度方式洗脱，得到流动相；
91.将陈醋混合液色谱的测定结果对应盐酸川芎嗪的标准曲线或线性回归方程，求得陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度；
92.再根据公式计算陈醋中川芎嗪的含量，
93.公式为：其中，
94.x为陈醋中川芎嗪的含量，mg/l；
95.c为陈醋混合液中川芎嗪的质量浓度，mg/l；
96.v为陈醋混合液的体积，ml；
97.m为反相高效液相色谱法中陈醋混合液的取样量，ml。
98.按信噪比等于3计算检出限，按信噪比等于10计算定量限，本发明方法的检出限为0.6mg/l，定量限为2mg/l。另外，取约45mg/l的陈醋做加标检测，根据测定结果计算得加标回收率为102.7％，符合95％～105％的范围；且在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值也不超过算术平均值的10％。可见，本发明的测定方法具有较高的准确度和精密度。
99.综上，本发明提供的陈醋中川芎嗪含量的测定方法，通过优化前处理步骤和重建色谱条件，不仅克服色谱柱缺少通用性的缺点，且测定的结果准确性更高，更适用于工业化的生产检测。
100.对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。