基于网络药理学和分子对接的四君子汤成分筛选方法及其应用

1.本发明属于中药研究开发领域，具体涉及的是一种基于网络药理学和分子对接的四君子汤成分筛选方法及其应用。


背景技术：

2.脾虚证是以胃肠功能紊乱为主的中医证候，多因饥饱失常、劳倦过度、思虑过度、或情志失调，而损伤脾胃所致。其临床主要表现为腹泻、食欲不振、神疲乏力等症状，导致胃肠消化吸收障碍、肠道炎症病变、免疫功能低下等损伤。流行病学研究显示，脾虚证在常见疾病中的发生率约为33.9％，尤其是肠易激综合征、炎症性肠病等胃肠疾病。目前脾虚证的治疗以中药复方或中成药为主，虽疗效确切，但其化学成分复杂，作用机制不清，这对于脾虚证的临床防治及其药物开发都存在一定困难。因此如何开发“质量可控、疗效可靠、独具知识产权”的用于防治脾虚证的组分中药，成为了本领域目前迫切需要解决的问题。
3.四君子汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、炙甘草以3:3:3:2的质量比组成，是脾虚证的经典方剂之一，在临床广泛使用。


技术实现要素：

1.本发明提出一种基于网络药理学和分子对接的四君子汤成分筛选方法，通过网络药理学和分子对接等技术对四君子汤的活性成分群进行筛选，从而进一步强化其修复肠上皮细胞损伤和治疗脾虚证的效果。
2.本发明是通过以下技术方案实现的:
3.本发明涉及一种基于网络药理学和分子对接的四君子汤成分筛选方法，通过网络药理学和分子对接技术对非多糖组份(nps)潜在活性成分进行筛选，再通过超高效液相色谱飞行时间质谱(uplc-qtof-ms/ms)对潜在活性成分进行定量分析，实现配方组成的确定和应用。
4.所述的潜在活性成分进行筛选是指:运用网络药理学通过在线数据库检索nps成分与脾虚证共同作用的靶点，经蛋白相互作用(ppi)获得四君子汤nps治疗脾虚证的核心靶点，通过kegg信号通路富集，运用cytoscape 3.7.1软件构建“成分-核心靶点-信号通路-疾病”互作网络，结合分子对接技术筛选四君子汤干预脾虚证的潜在活性成分；
5.优选地，潜在活性成分经液相色谱质谱法准确定量，按照其在nps中的质量份比组成活性成分配方(acc)。
6.所述的四君子汤的活性成分配方(acc)，其组分及重量比例为:人参皂苷ck 1.0～1.1份、人参皂苷rh22.1～2.2份、甘草醇3.0～3.2份、查尔酮a3.7～4.0份、白术内酯iii7.2～8.1份、人参皂苷rk37.5～8.7份、甘草次酸10.3～11.3份、甘草素110.4～118.6份、异甘草苷169.4～184.4份、人参皂苷rg1382.0～404.5份以及人参皂苷rb11008.3～1274.8份。
7.本发明涉及上述应用，将其用于制备修复划痕所致的肠上皮细胞损伤、治疗脾虚
证的药物。
8.所述的修复是指:高糖型dmem培养iec-6细胞至90％融合期，由10μl移液器吸头对细胞单层进行划伤，以形成均匀的无细胞创面；并用预冷pbs轻轻清洗两次以除去细胞碎片，构建肠上皮细胞创伤，药物可通过促进肠上皮细胞增殖、迁移，修复肠上皮细胞损伤。
9.所述的治疗脾虚证是指:改善利血平诱导的脾虚证功小鼠能障碍、改善脾虚证小鼠免疫器官萎缩、胃肠激素分泌紊乱。
附图说明
10.图1为活性组合配方中候选化合物的uplc-qtof-ms/ms正、负离子模式的总离子流示意图；
11.图2为基于网络药理学对acc中候选化合物的筛选整合信号通路示意图；
12.图3a为11个潜在活性化合物在uplc-qtof-ms/ms负离子模式下的总离子流(a)及提取离子流(b)示意图；
13.图3b为图3a局部放大示意图；
14.图4为acc对正常iec-6细胞生长作用的示意图；
15.图5为acc对划痕损伤iec-6细胞的迁移作用的示意图，图中:a:四君子汤nps对损伤iec-6细胞的迁移作用；b:acc对损伤iec-6细胞的迁移作用；c:四君子汤nps和acc对损伤iec-6细胞的迁移率；
16.图6为acc对利血平诱导脾虚证小鼠体重和脏器指数作用的示意图，图中:a:各组小鼠试验期间的体重变化；b:各组小鼠胸腺指数的变化；c:各组小鼠脾脏指数的变化；
17.图7为acc对利血平诱导脾虚证小鼠血清胃肠激素活性和血清淀粉酶活性的示意图，图中:a:各组小鼠血清中胃动素(mtl)含量；b:各组小鼠血清中生长抑素(ss)含量；c:各组小鼠血清中α-淀粉酶活性；
18.图8为acc对利血平诱导脾虚证小鼠小肠组织zo-1水平的示意图；
19.图9为acc对利血平诱导脾虚证小鼠小肠组织超微结构的示意图。
具体实施方式
实施例1
20.本实施例涉及一种四君子汤的活性成分配方的筛选及组成方法，包括:
21.步骤1)以人参、白术、茯苓、炙甘草质量比为3:3:3:2煎煮获得四君子汤水煎液，加入4倍体积无水乙醇经水提醇沉，收集上清液，经恒温水浴挥干、复溶、低温冻干，即得四君子汤的非多糖组分(nonpolysacharides,nps)；
22.步骤2)取步骤1)中nps样品，以70％甲醇水为溶剂，配制供试品溶液，结合液相质谱技术，采用正、负离子模式，进行液相色谱质谱分析，如图1所示，共指认110个化学成分；
23.步骤3)运用网络药理学通过tcmsp、ctd等多数据库联合获取nps成分与脾虚证共有靶点823个，其经string数据库和cytoscape3.7.1软件构建蛋白-蛋白相互作用网络，以degree》2median筛选186个靶点为其核心靶点；进而通过david数据库筛选获得31条与脾虚证疾病高度相关的信号通路，构建“成分-核心靶点-信号通路-疾病”互作网络，根据该互作网络中节点度、介数中心值、接近中心值排序绘制信号通路，如图2所示；
24.步骤4)将信号通路图中的核心靶点映射至“成分-核心靶点-信号通路-疾病”互作网络，运用autodockvina1.1.2软件与映射成分进行分子对接，发现18个成分与核心靶点的对接值affinity《-7或接近其本身配体(红色)，如表1所示；
25.步骤5)经液相色谱质谱法定量发现，18个成分中11个(人参皂苷ck、人参皂苷rh2、甘草醇、甘草查尔酮a、白术内酯iii、人参皂苷rk3、甘草次酸、甘草素、异甘草苷、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1)满足定量方法学，其总离子流图和定量结果分别如图3和表2所示；
26.表1四君子汤nps改善sds的关键化合物与核心靶点的结合亲和力s改善sds的关键化合物与核心靶点的结合亲和力
27.at i:atractylenolide i；at ii:atractylenolide ii；at iii:atractylenolide iii；ck:ginsenoside ck；cm1:scopoletin；cm12:glycyrol；cm15:umbelliferone；ch3:isoliquiritin；ch5:licochalcone a；d12:ginsenoside rb1；d19:ginsenoside rh2；fla 11:liquiritigenin；fla 39:luteolin；
28.fla 41:chrysin；ga:glycyrrhetinic acid；srt 3:poricoic acid a；t17:ginsenoside rg1；t24:ginsenoside rk3；
29.表2四君子汤nps中11个可定量化合物的方法学考察及其含量
30.上述11个可定量成分按照它们的质量比:人参皂苷ck1.0～1.1份、人参皂苷rh22.1～2.2份、甘草醇3.0～3.2份、查尔酮a3.7～4.0份、白术内酯iii7.2～8.1份、人参皂苷rk37.5～8.7份、甘草次酸10.3～11.3份、甘草素110.4～118.6份、异甘草苷169.4～184.4份、人参皂苷rg1 382.0～404.5份、人参皂苷rb1 1008.3～1274.8份，组成一种活性成分配方。实施例2
31.活性成分配方体外对肠上皮细胞损伤的作用
32.本实施例提供活性成分群在制备治疗肠上皮细胞损伤药物中的应用，采用划痕塑造大鼠小肠上皮隐窝细胞(iec-6)损伤，观察其对损伤肠上皮细胞的保护作用，具体为:
33.实验细胞:大鼠小肠上皮隐窝细胞(iec-6，上海中乔新舟生物科技有限公司)；iec-6细胞培养:iec-6细胞培养于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素-链霉素和10μg/ml胰岛素的高糖型dmem培养液(即10％fbs的完全培养基)中，置于37℃、5％co2的培养箱中；
34.本实施例活性成分配方的组成:人参皂苷ck、人参皂苷rh2、甘草醇、查尔酮a、白术内酯iii、人参皂苷rk3、甘草次酸、甘草素、异甘草苷、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1分别用dmso配制为100mm母液，经pbs缓冲液按1.0:2.1:3.0:3.7:7.3:7.5:10.3:110.4:169.4:382.0:1008.3进行稀释配制；
35.acc对正常iec-6细胞增殖作用:对数生长期的iec-6细胞，经0.25％胰酶消化为单细胞悬液后，以5
×
103cells/ml密度接种于96孔板中，以含10％fbs的完全培养基100μl培养12h(细胞长至60％)，弃取培养基，加入无血清培养基(即血清饥饿)培养12h。空白对照组加入100μl含有1％fbs的高糖型dmem培养基；各受试药组加入100μl含不同终浓度待测药的1％fbs的高糖型dmem培养基；以不含细胞、仅含1％fbs的高糖型dmem培养基100μl孔为调零孔。培养24h后，每孔加入10μl的cck-8，孵育1.5-2h后，酶标仪于450nm波长下检测od值，并计算细胞存活率；
36.细胞存活率(csr％)＝(待测药孔od-调零孔od)/(空白孔od-调零孔od)
×
100％
37.acc对划痕损伤iec-6细胞的修复作用:对数生长期的细胞长至80-90％时，0.25％胰酶消化为单细胞悬液，以3
×
105cells/ml的密度接种于6孔板，以2ml含10％fbs的完全培养基中培养24h(细胞长至融合)，用10μl移液器吸头对细胞单层进行划伤，以形成均匀的无细胞创面；用预冷的pbs轻轻清洗两次以除去细胞碎片。空白对照组加入2ml含1％fbs的高糖型dmem培养基；阳性对照组加入2ml含有10％fbs的高糖型dmem培养基；各受试药组加入2ml含不同终浓度待测药的1％fbs的高糖型dmem培养基。分别在给药0和24h时倒置显微镜(eclipsets100-f，nikon)下进行拍照，以迁移率(woundhealingrate)表示:woundhealingrate％＝(a
0-a
24
)/a0×
100％，其中:a0:areaofwoundat0h，a
24
:areaof woundaftertreatingdifferentdosageofdrugsfor24h.
38.acc对正常iec-6细胞生长作用的结果如图4所示(与1％fbs比较，
*
p《0.05)。血清饥饿(即无血清培养)iec-6细胞12h后，经质量浓度为0.025、0.05、0.10、0.2、0.4mg/ml的nps和acc孵育24h。发现与空白对照组相比，0.025～0.4mg/ml的nps和acc均呈剂量依赖性的显著增加iec-6细胞存活率，说明它们可快速刺激肠上皮细胞生长。且0.2mg/ml的acc对iec-6细胞的促增殖作用与0.4mg/ml的nps相比无显著性差异，意味着acc可在较低浓度下发挥与nps相似的作用；
39.acc对划痕损伤的iec-6细胞的迁移作用如图5所示(与1％fbs比较，
*
p《0.05)。不同质量浓度nps和acc与单层划痕iec-6细胞共孵育24h后，与空白对照组相比，0.2、0.4mg/ml的nps以及0.2mg/ml的acc显著促进损伤iec-6细胞迁移(p《0.05)，且0.2mg/ml acc(1.303
±
0.075)对iec-6细胞的迁移率与0.2、0.4mg/ml的nps(1.173
±
0.041、1.489
±
0.045)相比无显著性差异。表明，二者具有显著修复肠上皮损伤作用，且acc在较低浓度下发挥与nps相似的效果。实施例3
40.活性成分群对体内脾虚证小鼠的治疗作用
41.本实施例提供活性成分群在制备治疗脾虚证药物中的应用，以利血平诱导脾虚证(sds)小鼠模型，观察其对脾虚证的改善活性，具体为:实验动物:18～20g的icr小鼠(北京vital river)；acc配制:按照四君子汤nps中所含11个成分的质量含量计算，分别称取人参皂苷ck、人参皂苷rh2、甘草醇、查尔酮a、白术内酯iii、人参皂苷rk3、甘草次酸、甘草素、异甘草苷、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1适量，用30％聚乙二醇(医用级)配制成澄清溶液；
42.分组与处理:随机分为6组(n＝10/组):对照组(con)、脾虚证模型组(sds-m)、阳性对照组(sjzd)和3个待测组(nps、acc-l、acc-h)。所有实验程序均经上海交通大学动物伦理委员会批准(许可证号:20170005041349)。适应性饲养4天后，除对照组外，其余各组小鼠均连续7天腹腔注射利血平(0.35mg/kg
·
d)诱导脾虚证模型小鼠；从第8天开始，阳性对照组和待测药组小鼠分别灌胃给予sjzd(15g/kg
·
d)、nps(2.34g/kg
·
d)、acc-l(0.6g/kg
·
d)、acc-h(1.2g/kg
·
d)，灌胃体积为10ml/kg，连续干预7天；
43.对利血平诱导的脾虚证小鼠体重和脏器指数结果如图6(与空白组比较，
*
p《0.05；与模型组比较，
#
p《0.05)所示。与空白组相比，sds-m小鼠体重和胸腺指数显著降低(p《0.05)，且脾脏指数明显降低。经阳性药(sjzd)和待测药(nps、acc-l、acc-h)小鼠经连续7天的药物干预后，与sds-m组相比，sjzd、nps和acc均显著增加sds小鼠的体重以及胸腺指数，
且sjzd、nps显著增加sds小鼠的脾脏指数(p《0.05)，说明nps和acc可显著增加sds小鼠体重，并改善机体免疫功能，且acc-l对小鼠体重及胸腺指数的作用与sjzd、nps相比无显著性差异；
44.对利血平诱导脾虚证小鼠血清胃肠激素活性和血清淀粉酶活性如图7(与空白组比较，
*
p《0.05；与模型组比较，
#
p《0.05)所示。与空白组相比，sds-m小鼠血清中α-ams活性及mtl、ss含量显著升高(p《0.05)；与sds-m组相比，sjzd及acc-l显著逆转上述因子水平(p《0.05)，nps也显著降低mtl、ss含量，且acc与sjzd、nps相比无显著性差异。表明它们可改善由sds导致的炎症反应及胃肠激素分泌紊乱，从而缓解肠道运动障碍，且acc对sds小鼠胃肠运动的影响与sjzd、nps作用相似；
45.对利血平诱导脾虚证小鼠小肠组织zo-1水平如图8(与空白组比较，
*
p《0.05；与模型组比较，
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p《0.05)所示。与空白组相比，sds-m小鼠肠道zo-1水平较空白组显著降低(p《0.05)，说明sds导致小肠细胞间紧密度降低，存在“肠漏”风险；而sjzd、nps和acc-l可显著逆转zo-1水平以改善sds小鼠的肠屏障损伤；
46.对利血平诱导脾虚证小鼠小肠组织超微结构如图9所示。sds-m小鼠的肠道上皮细胞较空白组呈现明显损伤，主要表现为微绒毛破碎、微绒毛高度降低、细胞质空泡、上皮细胞间紧密连接结构破坏。sjzd、nps和acc干预后显著改善上述病理变化，修复肠上皮损伤，与上述体外实验结果一致。且acc-l效果与sjzd、nps相似，这表明acc是sjzd干预sds的有效组合；
47.经过具体实际实验，经液相色谱分析技术结合网络药理学技术，由四君子汤水煎剂中人参皂苷ck、人参皂苷rh2、甘草醇、查尔酮a、白术内酯iii、人参皂苷rk3、甘草次酸、甘草素、异甘草苷、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1按1.0:2.1:3.0:3.7:7.3:7.5:10.3:110.4:169.4:382.0:1008.3比例，可构建获得acc组分，其具有修复肠上皮细胞损伤、增加脾虚证小鼠体重、恢复脾虚证小鼠胃肠激素水平、修复脾虚证小鼠肠道损伤的功效。
48.与现有技术相比，本发明运用液相质谱分析技术结合网络药理学及生物活性评价技术，从四君子汤中获得一种活性成分配方，其物质基础明确、质量可控，经生物活性评价证明，该活性成分配方显著修复肠上皮细胞的损伤，且治疗利血平诱导的脾虚证外周免疫低下和肠道损伤。而西医的多种胃肠疾病，如肠易激综合征、慢性胃炎、炎症性肠病等，均归属于脾虚证范畴。因此，该活性组合配方可进一步开发制备用于治疗胃肠功能障碍的药物，拥有广阔的应用前景。
49.上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。