一种富含鸟嘌呤ssDNA22AG-4在敏化稀土铽离子（Ⅲ）发光中的应用

一种富含鸟嘌呤ssdna 22ag-4在敏化稀土铽离子(ⅲ)发光中的应用
技术领域
1.本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种富含鸟嘌呤ssdna 22ag-4在敏化稀土铽离子(ⅲ)发光中的应用。


背景技术：

2.传统的传感方法是使用一种传感器检测一个靶标物，因此开发不同靶标特异性响应的传感器通常需要投入大量的精力和物力。针对这一问题，人们开始致力于发展基于模式识别的阵列传感器—“化学鼻子/舌头(chemical nose/tongue)”。
3.荧光传感器主要由三部分组成，一是荧光供体，用来决定传感器的灵敏度，二是识别基元，可以选择性的与一定物质结合，三是桥连基团，起着连接供体与识别基元的作用。稀土离子有独特的发光特性，是良好的荧光供体，单链dna由a/t/g/c核苷酸碱基和磷酸基团组成，具有结构多样性和结构特异性，且大部分序列能够较低成本的人工合成，因此dna是一种非常合适的识别基元。
4.稀土元素由于其光谱特性，如发光寿命长、尖峰发射带和大斯托克斯等优点，引起了人们的极大关注。这些独特的性质能利用时间分辨光谱方法有效解决背景干扰的问题。tb
3+
由于独特的4f轨道而具有独特的光谱性质，直接激发tb
3+
发光是很困难的，但可以通过天线效应，即通过某些配体配位后敏化三价铽离子发光，可以较易的使tb
3+
发光，筛选富含g/t的dna配体敏化铽离子发光作为一种溶液中金属离子的智能模式传感器可以成功鉴别多种分析物，稀土离子构建的荧光探针与传统的传感方法相比具有操作简单、响应快捷、无标记以及廉价等优点。ssdna中的g可以和tb
3+
自组装形成超分子配位聚合物(tb/g)，具有很强的绿色荧光。
5.镧系稀土离子本身发光是很微弱的，但是当稀土离子与某些序列的ssdna特异性结合后，可以使得ssdna敏化稀土离子发光程度高达几千倍。从以往研究可知，单链dna可以与稀土铽离子特异性结合，但是双链dna却不行，且富含鸟嘌呤的ssdna对稀土铽离子的敏化发光起着重要作用。现有的ssdna仍存在对稀土铽离子敏化发光效果差的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种富含鸟嘌呤ssdna 22ag-4在敏化稀土铽离子(ⅲ)发光中的应用。本技术选用22ag-4的增敏效果更优，即本发明富含g和t序列的ssdna对tb
3+
发光具有显著增强效果。
7.本发明提供了一种ssdna 22ag-4在敏化稀土铽离子(ⅲ)发光中的应用，所述22ag-4的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了一种时间分辨tb
3+
/22ag-4荧光探针，将22ag-4在缓冲液中与铽离子(ⅲ)结合，得到tb
3+
/22ag-4荧光探针；所述22ag-4的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.优选的是，所述缓冲液包括tris-hac缓冲液。
10.优选的是，所述结合通过孵育进行，所述孵育的条件为37℃，8～15min。
11.优选的是，所述孵育时，22ag-4在缓冲液中的浓度为0.6～0.9μm；铽离子(ⅲ)在缓冲液中的浓度为1.5～2.5μm。
12.本发明还提供了上述技术方案所述tb
3+
/22ag-4荧光探针在时间分辨检测hg
2+
中的应用。
13.本发明还提供了一种时间分辨tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针，将22ag-4在缓冲液中与铽离子(ⅲ)结合，得到tb
3+
/22ag-4荧光探针；将hg
2+
与tb
3+
/22ag-4荧光探针混合孵育，得到tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针。
14.优选的是，所述孵育的条件为37℃孵育2～10min。
15.优选的是，所述孵育时，hg
2+
在缓冲液中的浓度为15～25μm。
16.本发明还提供了上述技术方案所述tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针在时间分辨检测cys中的应用。
17.本发明提供了一种富含鸟嘌呤ssdna 22ag-4在敏化稀土铽离子(ⅲ)发光中的应用。富含g和t序列的不同ssdna，其发光效果不同，本技术选用22ag-4的增敏效果更优，即本发明富含g和t序列的ssdna对tb
3+
发光具有显著增强效果。
18.本发明利用22ag-4和稀土铽离子(ⅲ)制备得到tb
3+
/22ag-4荧光探针，本发明还利用tb
3+
/22ag-4发光寿命长的特点以及hg
2+
能使tb
3+
/22ag-4荧光淬灭的特点，将tb
3+
/22ag-4荧光探针用于hg
2+
的时间分辨荧光快速检测。本发明还构建了tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针用于cys的检测，其检测出cys的浓度线性范围为15～40μm。本发明提供的稀土时间分辨荧光探针，具有抗干扰、灵敏度高、无标记的特点。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为本发明提供的增敏tb
3+
的更优ssdna筛选结果图；其中，(a)tb
3+
在不同序列ssdna存在下的时间分辨发光光谱图；(b)tb
3+
在不同序列ssdna存在下545nm处发光强度图；
21.图2为本发明提供的更优配体对增敏tb
3+
的最佳时间结果图；其中，(a)tb
3+
(2μm)/22ag-4(3μm)体系在不同时间下的时间分辨发光光谱图；(b)不同时间的tb
3+
(2μm)/22ag-4(3μm)体系在545nm处发光强度图；
22.图3为本发明提供的更优配体对增敏tb
3+
的最佳浓度结果图；其中，(a)不同浓度的22ag-4滴定2μm tb
3+
的发光变化图；(b)不同浓度22ag-4与tb
3+
结合后在545nm处发光强度变化图；
23.图4为本发明提供的tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针的构建中hg
2+
浓度的筛选结果图；其中，(a)不同浓度hg
2+
对tb
3+
/22ag-4的滴定时间分辨发光谱图；(b)不同浓度hg
2+
滴定tb
3+
/22ag-4在545nm处发光变化曲线图；
24.图5为本发明提供的tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针的构建中hg
2+
孵育时间的筛选结果图；其中，(a)tb
3+
/22ag-4/hg
2+
体系在不同时间下的时间分辨发光光谱图；(b)不同时间
22ag-4/tb
3+
/hg
2+
在545nm处发光强度图；
25.图6为本发明提供的tb
3+
/22ag-4/hg
2+
用于半胱氨酸(cys)的时间分辨荧光检测结果图；其中，(a)tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针对不同浓度cys的荧光响应光谱图；(b)tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针对不同浓度cys的发光强度(545nm)响应曲线图；(c)cys在15～40μm浓度范围的线性拟合图。
具体实施方式
26.本发明提供了一种ssdna 22ag-4在敏化稀土铽离子(ⅲ)发光中的应用，所述22ag-4的核苷酸序列如seq id no.1所示：ggggttggggttggggttgggg。采用不同序列的ssdna与tb
3+
结合敏化tb
3+
发光，开展ssdna的敏化条件优化，筛选出富含g和t序列的dna对tb
3+
发光具有显著增强效果。
27.本发明还提供了一种时间分辨tb
3+
/22ag-4荧光探针，将22ag-4在缓冲液中与铽离子(ⅲ)结合，得到tb
3+
/22ag-4荧光探针；所述22ag-4的核苷酸序列如seq id no.1所示。在本发明中，所述缓冲液优选包括tris-hac缓冲液。在本发明中，所述tris-hac缓冲液的ph值优选为7.9。在本发明中，所述结合通过孵育进行，所述孵育的条件优选为37℃，8～15min，更优选为37℃，10min。
28.本发明开展了不同浓度dna与tb
3+
敏化发光的条件优化。在本发明中，所述孵育时，22ag-4在缓冲液中的浓度优选为0.6～0.9μm，更优选为0.8μm；铽离子(ⅲ)在缓冲液中的浓度优选为1.5～2.5μm，更优选为2μm。
29.本发明还提供了上述技术方案所述tb
3+
/22ag-4荧光探针在时间分辨检测hg
2+
中的应用。核酸可以通过碱基和磷酸二酯主链与金属离子相互作用，hg
2+
可以和碱基t特异性的相互作用形成强而稳定的t-hg
2+-t，当加入hg
2+
后，ssdna与hg
2+
结合减弱了ssdna对tb
3+
发光的敏化效果，tb/g荧光被淬灭。最优tb
3+
/ssdna体系荧光强度随着hg
2+
浓度的增大而减弱，证实hg
2+
能使tb
3+
/ssdna体系荧光淬灭。
30.本发明还提供了一种时间分辨tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针，将22ag-4在缓冲液中与铽离子(ⅲ)结合，得到tb
3+
/22ag-4荧光探针；将hg
2+
与tb
3+
/22ag-4荧光探针混合孵育，得到tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针。在本发明中，所述孵育的条件优选为37℃孵育2～10min，更优选为5min。即tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针的总制备时间优选为10～25min，更优选为15min(即22ag-4和铽离子(ⅲ)孵育10min，tb
3+
/22ag-4和hg
2+
孵育5min)。在本发明中，所述孵育时，22ag-4在缓冲液中的浓度优选为0.6～0.9μm，更优选为0.8μm；铽离子(ⅲ)在缓冲液中的浓度优选为1.5～2.5μm，更优选为2μm。在本发明中，所述孵育时，hg
2+
在缓冲液中的浓度优选为15～25μm，更优选为20μm。
31.本发明还提供了上述技术方案所述tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针在时间分辨检测cys中的应用。把tb/g-hg
2+
作为一个时间分辨荧光生物传感器，生物硫醇对hg
2+
具有高度亲和性，当再加入含巯基的半胱氨酸cys后，tb/g-hg
2+
荧光又会恢复，从而实现cys的检测。即本发明构建tb
3+
/ssdna/hg
2+
荧光探针可用于半胱氨酸cys检测。通过cys与hg
2+
相互作用从而捕获体系中的hg
2+
，从而恢复tb
3+
/ssdna体系的荧光，实现对cys的时间分辨荧光检测，从而达到检测cys含量的目的。cys可以用来解酒精中毒等，并且是食品药品以及个人护理行业的重要前体，在现实中具有广泛的用途。
32.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种富含鸟嘌呤ssdna 22ag-4在敏化稀土铽离子(ⅲ)发光中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
33.实施例1
34.实验试剂如表1。实验所用核苷酸序列列表如表2所示。实验仪器如表3。
35.表1实验所用试剂列表
[0036][0037]
表2实验所用核酸序列列表
[0038][0039]
表3实验主要仪器
[0040][0041]
筛选增敏tb
3+
的更优ssdna
[0042]
采用5个不同序列ssdna(上海生工生物，其序列如表2所示)，筛选出能够敏化tb
3+
的最优配体。将五个不同序列ssdna先在小型离心机里离心2min，再按照ssdna配制要求加一定量的tris-hac缓冲液，配制完成后，将样品放置sk-1涡旋震荡仪中混匀。在ph＝7.9的tris-hac缓冲液中制备3μm ssdna和2μm tb
3+
溶液，将其混合物滴于96孔板中，贴好膜，置于多功能酶标仪中设置温度37℃孵育10分钟，设置多功能酶标仪在激发波长为290nm处测量时间分辨发光光谱，延长时间设置为50μs，积分时间2000μs，测量时间100ms。
[0043]
富含鸟嘌呤(g)的ssdna22ag-4作为tb
3+
的发光敏化配体
[0044]
根据文献报道，富含g的单链dna能敏化tb
3+
发光。首先，将不同结构的dna与tb
3+
进行孵育(dna浓度都为3μm，tb
3+
浓度为2μm)，实验结果如图1所示，其中，(a)tb
3+
在不同序列ssdna存在下的时间分辨发光光谱；(b)tb
3+
在不同序列ssdna存在下545nm处发光强度图。可以发现tb
3+
本身发出微弱荧光，在与dna结合敏化后，荧光强度大幅度提升，尤其是富含g的22ag-4(ggggttggggttggggttgggg)使其荧光强度增强约上千倍。由此得出结论，在这五个不同dna序列中，22ag-4敏化tb
3+
发光的效果最显著。
[0045]
筛选更优配体对增敏tb
3+
的最佳浓度
[0046]
为了筛选22ag-4的最佳敏化浓度，控制tb
3+
浓度相同(2μm)，滴加不同浓度的22ag-4(控制总体积相同为150μl)，筛选出使tb
3+
敏化发光的最佳浓度。将混合物置于多功能酶标仪中设置温度37℃孵育10分钟，设置多功能酶标仪在激发波长为290nm处测量时间分辨发光光谱，延长时间设置为50μs，积分时间2000μs，测量时间100ms。
[0047]
富含g序列的22ag-4敏化tb
3+
发光的更优条件
[0048]
在上述步骤中，已经得出22ag-4是更优敏化配体的结果。这里，主要探讨22ag-4敏化tb
3+
发光的更优条件。主要从两方面入手，一方面是对22ag-4/tb
3+
体系进行时间监测，探究更优结合时间；二是改变22ag-4的浓度，探究更优dna浓度对敏化tb
3+
发光的影响。首先，做时间监测，控制22ag-4/tb
3+
体系不变，用trf光谱测每隔2min的光谱图，从0min一直监测到30min，并且对各个时间段的545nm处的数据做散点图(545nm处发光最强)，结果如图2所示，其中，(a)tb
3+
(2μm)/22ag-4(3μm)体系在不同时间下的时间分辨发光光谱；(b)不同时间的tb
3+
(2μm)/22ag-4(3μm)体系在545nm处发光强度。可以发现22ag-4/tb
3+
体系发光持续时间长，发光稳定，0～15min发光强度没有明显变化，15min后发光强度稍微有所下降，但仍然发光明显。然后，探究22ag-4浓度的影响，控制其他条件不变，改变22ag-4浓度对22ag-4/tb
3+
体系进行光谱检测。根据时间监测图，控制22ag-4/tb
3+
体系孵育时间为10min，然后做trf光谱以及各浓度545nm处的折线图，如图3所示，其中，(a)不同浓度的22ag-4滴定2μm tb
3+
的发光变化；(b)不同浓度22ag-4与tb
3+
结合后在545nm处发光强度变化。发现信号强度随着22ag-4浓度的增加而增强，在0μm到0.4μm时的增幅较大，0.4μm以后，随着浓度的增加，信号强度增强较缓慢，0.8μm之后，信号强度随浓度增加趋于平缓。对0μm到0.4μm做拟合线，拟合线方程为y＝8024.47x+307.81，r2为0.9744。由此得出结论，22ag-4敏化tb
3+
发光的更优条件应控制孵育时间在15min内，选择22ag-4浓度为0.8μm。
[0049]
tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针的构建
[0050]
由于hg
2+
可以使tb
3+
/22ag-4体系发生荧光猝灭，通过在tb
3+
/22ag-4体系中(tb
3+
浓度为2μm，22ag-4浓度为0.8μm)滴加不同浓度的hg
2+
，将混合物置于多功能酶标仪中设置温度37℃孵育20min，设置多功能酶标仪在激发波长为290nm处测量时间分辨发光光谱，延长时间设置为50μs，积分时间2000μs，测量时间100ms。
[0051]
构建tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针
[0052]
在上述实验基础上加入不同hg
2+
浓度构建荧光探针，tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光体系中控制tb
3+
浓度为2μm，22ag-4浓度为0.8μm，改变hg
2+
浓度，并取545nm处的信号作曲线图，如图4所示，其中，(a)不同浓度hg
2+
对tb
3+
/22ag-4的滴定时间分辨发光谱；(b)不同浓度hg
2+
滴定tb
3+
/22ag-4在545nm处发光变化曲线。发现随着hg
2+
浓度的增大，在0～10μm之间，信号下降显著，做拟合线，拟合线方程为y＝-1724.8x+4422.2，r2＝0.9639。加入10μm之后，发光强
度基本平缓。
[0053]
然后，对tb
3+
/22ag-4/hg
2+
体系做一个时间监控，分别测tb
3+
/22ag-4/hg
2+
体系在2min、5min、10min、15min、20min、25min不同时间(此处时间不包括tb
3+
/22ag-4的制备时间)的trl光谱，对545nm处的信号做图，如图5，其中，(a)tb
3+
/22ag-4/hg
2+
体系在不同时间下的时间分辨发光光谱；(b)不同时间22ag-4/tb
3+
/hg
2+
在545nm处发光强度。发现0到2min荧光强度下降极为明显，5min后tb
3+
/22ag-4/hg
2+
体系的荧光强度下降极弱的发光且稳定。从而得出结论，构建tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针最好控制hg
2+
浓度为10μm以上，且孵育时间是tb
3+
/22ag-4体系先37℃孵育10min，后加hg
2+
再孵育5min来构建荧光探针。
[0054]
tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针用于cys的检测
[0055]
将tb
3+
、22ag-4、hg
2+
(浓度分别为2μm、0.8μm、20μm)逐个加入tris-hac缓冲液(ph＝7.9)中，构建tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针。为了对cys进行发光增强检测，在tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针中加入不同浓度的cys，溶液混合后在37℃继续孵育10min，用多功能酶标仪测时间分辨荧光光谱(trf)，激发波长为290nm，延长时间设置为50μs，积分时间2000μs，测量时间100ms。
[0056]
tb
3+
/22ag-4/hg
2+
用于半胱氨酸(cys)的时间分辨荧光检测
[0057]
含巯基的半胱氨酸(cys)能与hg
2+
作用而捕获hg
2+
，本发明将tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针用于cys的检测。控制tb
3+
/22ag-4/hg
2+
体系不变(tb
3+
、22ag-4、hg
2+
浓度分别为2μm、0.8μm、20μm)，加入不同浓度的cys，绘出在545nm处的荧光信号折线图。如图6所示，其中，(a)tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针对不同浓度cys的荧光响应光谱；(b)tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针对不同浓度cys的发光强度(545nm)响应曲线；(c)cys在15～40μm浓度范围的线性拟合。发现在15μm到40μm范围内光信号呈线性，拟合线方程为y＝155.49x-2044.77，拟合度r2＝0.9578。得出结论，tb
3+
/22ag-4/hg
2+
探针检测cys的线性范围为15～40μm。
[0058]
本发明利用时间分辨荧光光谱法从不同的ssdna序列(主要是含g数量不同)中确定了22ag-4(ggggttggggttggggttgggg)为敏化tb
3+
的更优配体，且从浓度和时间两个方面探究了tb
3+
/22ag-4体系更优条件，实验得到更优浓度为0.8μm，以及更优时间为37℃孵育10min。其次，利用tb
3+
/22ag-4发光寿命长的特点以及hg
2+
能使tb
3+
/22ag-4荧光淬灭的特点，设计了tb
3+
/22ag-4荧光探针用于hg
2+
的时间分辨荧光快速检测。最后，利用cys能捕获hg
2+
的能力，构建了tb
3+
/22ag-4/hg
2+
荧光探针用于cys的检测，确定检测的线性范围为15～40μm。本发明发展的检测体系与传统方法相比，具有操作方便、无标记、反应迅速等优势。
[0059]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。