一种寡核苷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种寡核苷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法。


背景技术：

2.寡核苷酸类化合物作为一种针对于基因层面上的治疗途径，靶点丰富，越来越受到新药研发人员的追崇，目前fda已经批准超过10款寡核苷酸药物进入市场，展现很强的治疗优势；
3.反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)是指人工合成的、与特定基因互补的寡核苷酸(dna或rna)及其类似物，长度为13-25个碱基的核酸片段，它可以通过碱基互补配对原则结合于靶基因或靶rna上，从而抑制基因的表达。很多遗传性、代谢性和病毒性疾病都是由于基因表达异常引起的。反义寡核苷酸作为药品的原理是利用碱基互补配对原则与特定的信使rna(messenger rna，mrna)进行配对，抑制其表达，阻断遗传信息从dna传递到蛋白质。根据核酸杂交原理，反义寡核苷酸能与特定的基因、病毒核酸或其转录产物结合，特异性抑制致病基因或病毒基因的表达。通过反义寡核苷酸抑制致癌基因或病毒的关键编码基因，可特异性抑制肿瘤细胞增殖生长并诱导细胞凋亡。靶向mrna或microrna的反义寡核苷酸，已被广泛用作分子生物学的研究工具，以特异性和选择性地下调特定基因的表达。基因表达的产物是蛋白质，传统小分子药物主要作用于致病蛋白质，而反义寡核苷酸药物则直接作用于致病基因本身，因此比小分子化学药物更具选择性，而且具有高效、低毒、稳定有效、不易产生耐药性等优点，是理想的抗癌和抗病毒药物。
4.在寡核苷酸的治疗过程中，药物如何到达靶向位置是研发的关键。目前常用的手段有阳离子脂质体、galnac、ppmo等技术手段来递送到靶点位置，干扰靶向组织的异常蛋白的表达，从而达到治疗疾病的效果。
5.在寡核苷酸的新药研发过程中，一般采用常规的液相方法用于测定原料药制备过程中的纯度标定，但是对于生物样本中寡核苷酸的浓度测定时，其他的检测手段如rt-pcr、杂交-连接elisa等在成本上和检测方式上有很大的挑战。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一种寡核苷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法，包括如下步骤：
7.s1.样品处理；
8.s2.采用液相色谱-质谱联用仪对样品进行检测；
9.其中，步骤s2中液相色谱条件为：采用反相色谱柱；流动相a为水性流动相，有机相成分为0％～10％甲醇，同时含有0.2～1％六氟异丙醇和0.1～0.2％的叔胺；流动相b为有机流动相，有机相成分为85～95％甲醇，同时含有0.2～1％六氟异丙醇和0.1～0.2％的叔胺；进样器温度为4-8℃；进样量为1.0～10.0μl；流速为0.4ml/min；基于洗针液r0和r3的梯
度洗脱程序为0～0.50min、5～20％b，0.50～2.50min、95％b，2.50～3.50min、95％b，3.50～3.51min、5～20％b，3.51～4.50系统控制；
10.其中，步骤s2中质谱条件为：扫描方式为选择离子监测，离子化模式为负离子模式，离子源为电喷雾离子源，碰撞气压力中等，帘气压力为25psi，雾化气压力为40psi，辅助气压力为50psi，喷雾电压为-4500v，雾化气温度为550℃。
11.其中，步骤s1中，样品湿冰环境温度下融化后，涡旋混匀；取定量样品至96孔板中；向96孔板中分别加入定量内标工作溶液，加入苯酚和氯仿的混合溶液(v/v＝2：1)，混合均匀，将96孔板放入离心机进行离心；转移定量上清溶液至96孔板后，吹干，用定量水复溶；震荡，然后将溶液转移到进样板中进样。
12.其中，步骤s2中，流动相a配制时，按体积比取定量h2o至玻璃瓶中，加入一定比例的甲醇并加入六氟异丙醇和叔胺，混匀后超声15分钟。
13.具体的，步骤s2中，流动相a配制时，所述的叔胺为三乙胺或n,n-二异丙基乙胺。
14.其中，步骤s2中，流动相b配制时，按体积比例取定量h2o和甲醇至玻璃瓶中，加入定量的六氟异丙醇和叔胺，混匀，混匀后超声15分钟。
15.具体的，步骤s2中，流动相b配制时，所述离子对试剂为六氟异丙醇，叔胺主要为三乙胺或n,n-二异丙基乙胺。
16.其中，步骤s2中，洗针液r0和r3配制时，按体积比例取定量乙腈和定量h2o至玻璃瓶中，加入定量的氨水，混匀。
17.其中，步骤s2中，质谱检测时，待测物的q1为[m-n]/n，其中q1为母离子的质量和电荷数的比值，m为待测物的单一同位素分子量，n为寡核苷酸的带电数；寡核苷酸类化合物的子离子为核苷酸的单体碎片，质荷比为79(磷酸根)、111(胞嘧啶)、134(腺嘌呤)、150(鸟嘌呤)和319(胸腺嘧啶)；检测的母离子为[m-n]/n，子离子可为79、111、134、150和319的任何一个。
[0018]
通过上述技术方案，本发明的目的是开发一种简单便捷的液相串联质谱的方法以满足于寡核苷酸类化合物的半定量和定量的生物样本分析检测；液相系统部分的流动相使用一定比例的离子对的流动相，并对离子对的浓度进行控制，以满足大部分的寡核苷酸的浓度检测工作，采用质谱mrm检测模式解决了寡核苷酸检测传统方法干扰大的问题，很好的提高了寡核苷酸类化合物方法的稳定性和特异性，同时通过计算机辅助有效解决了液相质谱方法对三磷酸化合物标准品的依赖。
附图说明
[0019]
图1为实施例中计算机辅助计算化合物的质谱参数图；
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图2为实施例中寡核苷酸化合物在大鼠血浆中的浓度检测标准曲线；
[0021]
图3为实施例中大鼠血浆体内的药代动力学曲线。
具体实施方式
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本实施例以代表性化合物tcgtacctttctcaccacagtatc*t为例对本发明提供的寡核苷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法进行描述。
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1、实验目的：
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建立tcgtacctttctcaccacagtatc*t的lc-ms/ms分析方法，用于测定s-d大鼠肝组织、血浆以及细胞中寡核苷酸的浓度。
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2、实验材料：
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2.1实验仪器
[0027][0028][0029]
2.2实验试剂
[0030][0031]
2.3溶剂信息
[0032]
[0033][0034][0035][0036][0037]
注：在必要时可以按比例改变溶液配制体积，实际配制体积将会在实验记录中录入。
[0038]
3液相质谱条件：
[0039]
3.1液相条件
[0040][0041]
3.2质谱条件
[0042][0043][0044]
4、样本的处理过程：
[0045][0046]
5、定量方法：
[0047][0048]
6、基于1-5的条件，具体实施方式描述如下：
[0049]
6.1流动相a的配制：精移取500ml h2o至1000ml的玻璃瓶中，加入1毫升的六氟异丙醇和0.5毫升的三乙胺，混匀，混匀后超声15分钟；其中，六氟异丙醇的用量仅为0.2％，可以减少对色谱系统和质谱仪器的损害，同时可以增加方法的稳定性；
[0050]
6.2流动相b的配制：精移取475ml甲醇和25ml的水至1000ml的玻璃瓶中，加入1毫升的六氟异丙醇和0.5毫升的三乙胺，混匀，混匀后超声15分钟；其中，六氟异丙醇的用量仅为0.2％，可以减少对色谱系统和质谱仪器的损害，同时可以增加方法的稳定性；
[0051]
6.3化合物的洗脱主要是通过六氟异丙醇来改性色谱柱来达到保留，然后通过三乙胺等叔胺和甲醇来对保留在色谱柱上的寡核苷酸化合物进行替换和洗脱，三乙胺的含量一般很低，如果比例较大，虽然洗脱较好，但是会在离子源处抑制化合物的信号，导致方法检测限无法满足分析要求；
[0052]
6.4洗脱条件：梯度洗脱时，液相保留主要是让化合物在高比例的流动相a存在的条件下在色谱柱上结合，然后通过流动相b进行洗脱；其中，流动相a通过6.1的方式进行配制，流动相b通过6.2的方式进行配制；
[0053]
6.5质谱检测：质谱条件的确定是先确认负离子模式下母离子的分子离子峰[m-n]/n，和其二级碎片79.0；其中，m是单一同位素分子量是通过计算机算出其分子量；二级碎片是此类化合物的特征碎片，来源于化合物的磷酸碎片；
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6.6计算机辅助计算化合物的质谱参数如图1所示；
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6.7一种寡核苷酸化合物在大鼠血浆中的浓度检测实施例：
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6.7.1标准曲线信息如图2所示；
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6.7.2样本检测浓度汇总如下表所示：
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动物编号时间点(min)浓度(ng/ml)rat-015748
rat-0115650rat-0130563rat-0160445rat-0112093.7rat-0118064.1rat-0136047.5
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6.7.3大鼠血浆体内的药代动力学曲线如图3所示。
[0060]
基于上述实施例可以，本发明开发的一种简单便捷的液相串联质谱的方法可以有效满足于寡核苷酸类化合物的半定量和定量的生物样本分析检测；液相系统部分的流动相使用一定比例的离子对的流动相，并对离子对的浓度进行控制，以满足大部分的寡核苷酸的浓度检测工作，采用质谱mrm检测模式解决了寡核苷酸检测传统方法干扰大的问题，很好的提高了寡核苷酸类化合物方法的稳定性和特异性，同时通过计算机辅助有效解决了液相质谱方法对三磷酸化合物标准品的依赖。
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对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。