岩黄连指纹图谱的检测方法与流程

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及岩黄连指纹图谱的检测方法。

背景技术：

1、中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。通过中药指纹图谱的建立，能比较全面反映中药所含化学成分的种类与数量，尤其是现在对绝大多数中药的有效成分不明确的情况下，能更好的表明中药的内在质量，提高中药质量评价的技术水平和科技含量。

2、岩黄连，岩黄连为罂粟科植物石生黄堇corydalis saxicola bunting的干燥全草，具有清利湿热，止血止痛的功效，可用于治疗肝炎，口腔溃疡，牙龈肿痛，带下，腹泻，痢疾，痔疮出血，肿瘤等症。

3、现有技术中，关于岩黄连的质量研究报道很少，本发明在现有技术的基础上，本研究主要针对其主要成分的指纹图谱，可以更好的控制产品质量。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种岩黄连的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价岩黄连的质量，对控制岩黄连的质量和保证临床疗效具有重要意义。

2、为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、本发明的第一个目的是提供一种岩黄连指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

4、步骤1、岩黄连供试品溶液的制备：

5、精密称取不同批次的岩黄连，加体积百分比为50％-100％的乙醇，超声，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；

6、作为超声处理的常规操作，在本发明的某个特殊的实施例中，步骤1的具体操作为：精密称取不同批次的岩黄连，置锥形瓶中，加50％-100％乙醇，称重，超声处理，冷却至室温，溶剂补足失重，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

7、步骤2、混合标准品溶液的制备：

8、精密称定脱氢甲卡维汀、脱氢异阿朴卡维汀、脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱标准品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合标准品溶液；

9、步骤3、精密吸取步骤2的混合标准品溶液，注入高效液相色谱仪，记录混合标准品色谱图；

10、步骤4，分别精密吸取步骤1的各批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图；

11、步骤5，将步骤4中获得的供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次岩黄连供试品的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成岩黄连的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合标准品溶液色谱图的保留时间，标注岩黄连的对照指纹图谱中峰的化学成分，得到岩黄连的指纹图谱。

12、进一步的，步骤1中所述岩黄连经粉碎；所述乙醇体积百分比为50％-80％；所述超声时间不低于15min；所述岩黄连的质量m与乙醇的体积v的比例为m:v＝1g/(100-250)ml；优选的，所述岩黄连粉末过三号筛；优选的，超声时间为15-60min。

13、进一步的，步骤2混合标准品溶液的浓度为脱氢甲卡维汀100ug/ml、脱氢异阿朴卡维汀40ug/ml、脱氢卡维丁160ug/ml、盐酸巴马汀100ug/ml、盐酸小檗碱20ug/ml。

14、进一步的，步骤3、步骤4中，液相色谱条件为：

15、色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

16、流动相：a相为体积分数为0.01-0.05mol/l的磷酸二氢钾水溶液，b相为乙腈；

17、洗脱程序：采用体积分数30-95％a相，5-70％b相，梯度洗脱；

18、流速：0.8-1.2ml/min；

19、柱温：30-40℃；

20、进样体积：10-20μl；

21、检测波长：345±5nm。

22、进一步的，所述流动相为0.05mol/l磷酸二氢钾水溶液(a)-乙腈(b)。

23、进一步的，所述洗脱程序为：

24、

25、

26、进一步的，所述流速为1ml/min，柱温为30℃，进样体积为10μl，检测波长为345nm。

27、本发明的第二个目的是提供采用前述的建立方法得到的岩黄连指纹图谱。

28、进一步的，所述岩黄连指纹图谱中共有峰17个，识别5个成分，其中脱氢甲卡维汀保留时间为33.925为10号峰；脱氢异阿朴卡维汀的保留时间为35.200min，为11号峰；脱氢卡维丁的保留时间为41.800min，为14号峰；盐酸巴马汀的保留时间为45.250min，为16号峰；盐酸小檗碱的保留时间为46.650min，为17号峰。

29、本发明的第三个目的是提供前述的岩黄连指纹图谱在中药岩黄连质量控制中的应用。

30、指纹图谱检测条件的优化：

31、1、在供试品制备方面优化方面

32、申请人采用水、甲醇、盐酸水、盐酸甲醇、不同比例的乙醇作为提取溶剂进行考察时，发现50％-100％乙醇为提取溶剂时，能够满足检测要求，尤其以50％-80％乙醇为提取溶剂时，岩黄连峰容量较多，响应值较高，故选择提取溶剂为50％-80％乙醇。

33、比较超声法、回流提取法提取方式，结果表明超声提取法峰面积较高。比较提取时间为15、30、45、60min，发现超声15min已提取完全。

34、2、在色谱条件进行优化方面

35、本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，对供试品溶液进行全波长扫描，结果在检测波长为345nm时，色谱信息较为丰富响应值普遍偏高，因此选择345nm为检测波长；

36、本发明对流动相甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-磷酸二氢钾水溶液进行考察，结果表明，以磷酸二氢钾水溶液-乙腈洗脱时，色谱峰分离度和峰形较好，故流动相确定为磷酸二氢钾水溶液-乙腈，且磷酸二氢钾水溶液浓度为0.01-0.05mol/l。

37、在优选出最佳的流动相组成后，由于岩黄连主要含有生物碱类成分，如黄连碱、小檗碱、甲基黄连碱、药根碱等。等度洗脱方式不能很好的实现各成分的良好分离，因此本发明继续筛选了梯度洗脱方式，筛选得到最佳的梯度洗脱方式为：

38、

39、有益效果：

40、1、本发明根据岩黄连中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的岩黄连指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价中药岩黄连的质量，为保证临床中药岩黄连疗效具有重要意义。

41、2、用本发明所提供的方法所建立的岩黄连指纹图谱，能有效地表征中药岩黄连的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定中药岩黄连质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

42、3、本发明提供的岩黄连指纹图谱的检测方法，共有峰占全谱峰峰面积90％以上，识别峰峰面积占全谱峰峰面积60％以上，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。