检测人样品中蛋白质的方法以及这样的方法的用途与流程

本发明涉及用于测量人样品，特别是人血清、血浆或血液中的蛋白质的方法的领域，并且还涉及测定以及这样的测定的用途，特别是用于风险评估。

背景技术：

1、测量人的人样品中的蛋白质是用于对人的一般状况，特别是关于人的营养和健康状态进行监督和风险评估的强有力工具。

2、前列腺癌(prostate cancer，pca)是男性中最频繁诊断的癌症并且是美国男性癌症相关死亡的第二主要原因。

3、尽管有数十年的研究努力，但pca的诊断和治疗仍然是临床上的一个主要挑战。遗憾的是pca的进展是无声的，并且早期检测进展更快和潜在危险的病变对患者的健康至关重要，因为仅在疾病的早期阶段是有可能完全缓解和治愈疾病。

4、针对pca检测最经常使用的非侵入性测试依赖于血液中前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，psa)的测量连同直肠指检(digital rectal examination，dre)。psa是由前列腺上皮细胞产生的蛋白质。psa也称为激肽释放酶iii、精囊素(seminin)、精囊蛋白酶(semenogelase)、γ-精浆蛋白(γ-seminoprotein)和p-30抗原，并且其是少量存在于正常男性的血清、血浆或血液中的34kd糖蛋白，并经常在存在pca的情况下和在其他前列腺病症中升高。测量psa的血液测试连同dre是目前可用于早期检测pca的最有效的测试。高于正常水平的psa与局部性和转移性pca二者相关。

5、单独psa的诊断准确性仅约60％并且该方法在特异性方面具有重大缺陷(经历不必要的前列腺活体组织检查或手术的假阳性病例太多)。事实上，前列腺感染、刺激、良性前列腺肥大(增大)或增生(benign prostatic hypertrophy(enlargement)or hyperplasia，bph)以及近期射精也可提高psa水平，产生假阳性结果。

6、因此，pca诊断目前因psa评价的高假阳性率而受到阻碍，其结果可导致大量具有阴性诊断结果的前列腺活体组织检查。此外，这些不必要的活体组织检查可有潜在的副作用。最近反对使用psa广泛筛查男性pca的建议导致更少的男性筛查pca，并且更少的早期病例被检测到。

7、因此，尽管基于同时测量多种参数(例如游离psa和总psa)的新的方法正在成为提高总体诊断准确性的工具，但仍然缺乏避免假阳性和假阴性结果的可靠且非侵入性的诊断/预后操作。血液中的大多数psa与蛋白质结合。少量不是蛋白质结合性的，并被称为游离psa。在患有前列腺癌的男性中，游离(未结合)psa与总psa的比值降低。如果游离psa与总psa的比值(％fpsa)低于25％，则癌症的风险提高。比值越低，pca的可能性越大。然而，总psa和游离psa二者在射精之后都立即提高，在24小时内缓慢恢复到基线水平，并且与pca无关的其他机制也可影响游离psa与总psa的比值。

8、迫切需要新的诊断工具，理想的非侵入性工具以提高pca诊断并降低不必要的活体组织检查和过度治疗。来自容易获取的样品类型例如血液的更准确的诊断将使得医师和患者对于潜在的pca病例以及是否需要前列腺活体组织检查做出更明智的决策。

9、与诊断类似，pca的治疗和/或预后由于该疾病的异质性而仍然是一大挑战。尽管已经提出了pca的多种机制，但是缺乏能够对患者进行分层的合适特征并且用于治疗性干预治愈的关键靶蛋白仍然不可获得。

10、在wo 2009/138392中提出了一种发现用于前列腺癌的合适诊断系统的方法，其中提出测量已知存在于人血液中的24种蛋白质的列表中的至少两种，并且预期其根据对应患者的健康状态而被下调或上调。

11、已知方法的问题在于其仍然缺乏关于癌症实际存在的灵敏度且特别是特异性，并且缺乏关于避免假阳性结果和假阴性结果的诊断可靠性。另一个问题是相应检测探针的实际可用性，无论是基于抗体的检测还是任何其他类型的检测，使得相应的工具不仅适用于学术目的而且还适用于广泛应用。另一个问题是相应的检测系统应简单并且不需要大量的单独测量。

12、wo-a-2018011212提出了用于收集关于对象健康状态之信息的方法，其包括在对象的血清、血浆或血液中定量检测thbs1的浓度、游离psa的比例(％fpsa)，优选包括选自ctsd、olfm4、icam1的至少一种蛋白质的浓度。

13、pca可通过根治性治疗例如根治性前列腺切除术(radical prostatectomy，rp)来管理，其提供了对局部性pca的极好的癌症控制。约30％的手术治疗的男性将经历生化复发(biochemical recurrence，bcr)，从而处于临床癌症进展(转移)的显著风险中，并且需要制定全身性治疗。

14、已表明临床分期、治疗前psa水平和前列腺活体组织检查gleason分级是治疗无效的可靠且独立的预测因子。临床风险概况(治疗前列线图(例如kattan或capra评分)被设计成鉴定可安全避免侵袭性治疗的患者或选择用于新辅助临床试验的潜在候选者。

15、然而，当前模型的有用性取决于其预测的准确性。在psa定期用于筛查的群体中，术前psa水平可主要反映良性前列腺增生(bph)而不是pca的存在。在活体组织检查之后，预测pca的侵袭性是困难的，即使在其算法中使用了并入临床信息的列线图也是如此。这尤其适用于疾病进展风险低和极低的患者，对于所述患者主动监测正成为广泛采用的策略。

16、us-a-2020292548公开了用于在对象中诊断前列腺癌生化复发(bcr)的存在的方法，这样的方法包括检测多种诊断bcr的生物标志物的水平。还提供了用于检测本发明生物标志物的以试剂盒和试剂组形式的组合物。

17、oguic et al在patholog res int.2014；2014:26219中评价了基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，mmp-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，mmp-9)在前列腺癌中在主要肿瘤块和肿瘤细胞中在阳性切缘处的表达以及这些生物标志物对前列腺切除术患者中疾病的生化复发的影响。对120例存档的前列腺癌样品的组织微阵列进行针对mmp-2和mmp-9表达的免疫组织化学评价，并将其与临床病理参数进行比较。与切缘阴性的肿瘤相比，手术切缘阳性的肿瘤显示出显著更高的mmp-9总体表达(p＝0.0121)。在来自具有生化复发的患者的肿瘤中，mmp-9表达显著升高(p＝0.0207)。在切缘阴性的患者组中，高于截止值的mmp-9表达与复发显著相关(p＝0.0065)。多变量分析表明mmp-9是生化复发的良好预测因子(优势比＝10.29；p＝0.0052)。mmp-2在肿瘤细胞中的表达在阳性切缘处显著高于在主要肿瘤块中(p＝0.0301)。该结果强调了mmp-2和mmp-9表达对于预测前列腺切除术之后具有手术切缘阳性和阴性的前列腺肿瘤行为的潜在价值。

18、miyata et al在prostate.2015jan；75(1):84-91中报道了进行新辅助激素治疗(neoadjuvant hormonal therapy，nht)以改善器官局部性前列腺癌的结局。然而，关于血管生成与nht之间的关系的信息很少。该研究的目的是确定合适的方法来评价组织的血管生成状态，并确定该方法对nht之后经受了根治性前列腺切除术的患者中的生化复发的预后价值。他们分析了来自通过根治性前列腺切除术治疗的患者的108个经福尔马林固定的标本。在48例患者(52.9％)中施用nht，并选择60例具有相似的gleason评分和pt分期的患者作为非nht治疗的对照组。使用抗cd31、抗cd34和抗cd105抗体来测量微血管密度(microvessel density，mvd)。还通过免疫组织化学来评价血管内皮生长因子(vegf)-a和血小板应答蛋白(tsp)-1的表达。研究cd31-mvd、cd34-mvd和cd105-mvd对生化复发的预后价值。报道了nht组中cd105-mvd的平均值/sd(13.3/4.7)显著(p<0.001)低于非nht组中cd105-mvd的平均值/sd(125.8/7.3)。在nht组中，cd105-mvd与pt分期相关，并且其与vegf-a表达呈正相关(r＝0.56，p<0.001)且与tsp-1表达呈负相关(r＝0.42，p＝0.003)。cd105-mvd被确定为是用nht治疗的患者中生化复发(bcr)的重要预测因子(对数秩检验，p<0.001)。尽管cd31-mvd和cd34-mvd在非nht组中与pt分期或gleason评分显著相关，但其在nht组中与病理特征和bcr不相关。其结果表明cd105-mvd反映了用nht治疗的前列腺癌组织中的血管生成状况。cd105-mvd也被确定为是采用nht经受根治性前列腺切除术的前列腺癌患者中生化复发的重要且独立的预测因子。

19、coulsen-thomas et al在experimental cell research 319(7)中报道了肿瘤周围的间质反应导致肿瘤特异性微环境的形成，其可在肿瘤的生长和进展中发挥限制性作用或支持性作用。光蛋白聚糖，即胞外基质(extracellular matrix，ecm)的富含亮氨酸的小蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan，slrp)，调节胶原原纤维生成。最近，还表明光蛋白聚糖在胚胎发育、组织修复和肿瘤进展期间调节细胞行为。光蛋白聚糖在癌症中的作用根据肿瘤的类型变化。在该研究中他们在体内和体外二者中分析了光蛋白聚糖在前列腺癌发病机制中的作用。在通过实时pcr和免疫染色二者分析的原发性肿瘤中观察到光蛋白聚糖的总体上调。在泡状腺周围具有纤维沉积的前列腺原发性肿瘤周围的反应性基质中观察到光蛋白聚糖表达的提高。体外分析表明光蛋白聚糖抑制了从淋巴结、骨和脑中分离的转移性前列腺癌细胞的迁移和侵袭二者。此外，接种在光蛋白聚糖上的前列腺癌细胞表现出细胞突起的形成降低、板状伪足的形成降低(通过zo-1、角蛋白8/18、整合素β1和mt1-mmp的降低重排而检出)和侵袭性伪足的形成降低(通过α-平滑肌肌动蛋白、皮动蛋白和n-wasp的破坏而检出)。此外，通过光蛋白聚糖敲除小鼠的腹膜观察到前列腺癌细胞侵袭的显著提高，进一步表明了存在于ecm中的光蛋白聚糖对前列腺癌侵袭的限制性作用。总之，存在于前列腺原发性肿瘤周围的反应性基质中的光蛋白聚糖在癌症进展中发挥限制性作用，并因此我们假设光蛋白聚糖可以是前列腺癌分期中有价值的标志物。

20、behnsawy et al在bju int.2013jan；111(1):30-37中报道了旨在分析在局部性前列腺癌(prostate cancer，pc)中上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymaltransition，emt)中所涉及的多种分子标志物的表达模式，以阐明这些标志物在经历根治性前列腺切除术(rp)的患者中的意义。通过免疫组织化学染色来评价来自197例连续的具有局部性pc的患者的rp标本中13种emt标志物的表达水平，所述标志物即e-钙黏着蛋白、n-钙黏着蛋白、β-联蛋白、γ-联蛋白、纤连蛋白、基质金属蛋白酶(mmp)2、mmp-9、slug、snail、twist、波形蛋白、zeb1和zeb2。在13种标志物中，e-钙黏着蛋白、snail、twist和波形蛋白的表达水平与多种常规预后因子密切相关。单变量分析确定这四种emt标志物作为生化复发(br)的重要预测因子，而血清前列腺特异性抗原、gleason评分、精囊侵犯(seminalvesicle invasion，svi)、手术切缘状态(surgical margin status，sms)和肿瘤体积也是重要的。在这些重要因子中，twist和波形蛋白、svi和sms的表达水平在多变量分析中显示出与br独立相关。根据这四种独立因子的阳性数目，无br存活存在显著差异。即在90例针对风险因子呈阴性的患者中有4例发生br(4.4％)，在83例针对一种或两种风险因子呈阳性的患者中有21例发生br(25.3％)，以及在24例针对三种或四种风险因子呈阳性的患者中有19例发生br(79.2％)。除了常规预后参数之外，表明了在rp标本中测量潜在的emt标志物，特别是twist和波形蛋白的表达水平，将有助于准确预测rp之后具有局部性pc的患者中的生化结局。

21、bair et al.在prostate.2006feb 15；66(3):283-93中报道了90k/mac-2结合蛋白是表达水平与许多不同肿瘤类型中的转移潜力相关的细胞黏附蛋白。该研究的目的是检查前列腺癌中的90k表达并确定90k在癌症进展中的可能作用。通过免疫组织化学来评价前列腺细胞系和组织样品中的90k表达。还通过western印迹分析和实时rt-pcr来评价在细胞系中的表达。通过elisa来评价90k对重组基质金属蛋白酶前体(promatrilysin)的诱导。一些所研究的人前列腺细胞系表达90k。90k在38.8％的前列腺癌肿瘤样品、7.14％的pin病变和18.6％的正常组织中过表达。还表明90k在前列腺细胞系lncap中诱导重组基质金属蛋白酶前体表达。这些数据表明90k在大部分恶性肿瘤中过表达。90k可诱导重组基质金属蛋白酶前体表达的事实表明90k在癌症进展和转移中的可能作用。这表明90k过表达可以是用于检查前列腺癌进展的有用标志物。

22、wo-a-2018011212公开了，提出的用于收集关于对象健康状态之信息的方法，其包括在对象的血清、血浆或血液中定量检测thbs1的浓度、游离psa的比例(％fpsa)，优选包括选自ctsd、olfm4、icam1的至少一种蛋白质的浓度。

技术实现思路

1、因此，迫切需要鉴定与生物学侵袭性pca的存在特异性相关的新的标志物以用于具有psa水平中度升高的群体中的结局的改进的预测。由于目前主要基于总psa水平和标准病理肿瘤分级的模型的这些局限性，因此我们研究了替代的pca相关生物标志物及其与具有临床局部性pca的患者中的bcr和不良病理状况(adverse pathology，ap)的相关性。

2、我们使用小鼠模型和蛋白质组学技术对最初在pten突变背景下发现的多种蛋白质生物标志物进行了单变量和多变量分析。与前列腺癌风险评估(cancer of theprostate risk assessment，capra)评分相比，评价了多种生物标志物与临床分级组(grade group，gg)和psa一起组合的临床表现以用于预测rp之后的bcr。另外，还研究了与ap的相关性。

3、因此，目的是确定新的生物标志物组合在经受根治性前列腺切除术(rp)的pca患者中的预后效用。

4、在martini clinic(hamburg，germany)的pca临床分期(clinical stage，ct)<3的经受rp的557名男性的血清样品和临床数据用于分析。使用活体组织检查样品来确定gg，同时使用免疫测定来测量血清中的肿瘤标志物浓度。使用cox比例风险回归和kaplan-meier分析来评估所提出的标志物组合的预后效用。将该表现与总组群和低风险患者亚群中的capra评分进行比较。

5、建立了包含纤连蛋白1(fibronectin 1，fn1)、半乳凝素-3结合蛋白(galectin-3-binding protein，lg3bp)、光蛋白聚糖(lumican，lum)、基质金属蛋白酶9(matrixmetalloprotease 9，mmp9)、血小板应答蛋白-1(thrombospondin-1，thbs1)和psa与gg一起的多变量模型。所提出模型是bcr的重要预测因子(hr 1.28/5单位评分，95％ci 1.19至1.38，p<0.001)。kaplan-meier分析表明，与capra评分相比，所提出模型对在rp之后的低风险疾病具有更好的预测(分别为4.9％vs.9.1％的bcr可能性)。在预限定的低风险群体亚群中，使用所提出模型的bcr风险低于5.5％，并因此当与capra评分＝0至2(9％)、gg<2(7％)和nccn＝低风险(6％)亚群相比时更低。另外，所提出模型可显著(p<0.001)区分在rp时具有ap事件的患者与不具有ap事件的患者。

6、因此，所提出模型在总组群以及在预限定的低风险患者群体亚群中针对rp之后bcr的预测出乎意料且显著地优于capra评分。其也与在rp时的ap显著相关。

7、更一般而言，本发明涉及如所附权利要求书中所述的方法。

8、所要求和描述的是用于收集关于对象健康状态之信息的方法，其包括在对象的血清、血浆或血液中定量检测选自以下的系统(system)中至少四种的浓度：thbs1、lum、fn1、lg3bp、mmp9以及(总)psa。

9、根据第一个优选的实施方案，该方法包括在对象的血清、血浆或血液中定量检测thbs1、lum、fn1、lg3bp、mmp9以及psa中每一种的浓度。

10、特别优选地，还将至少一个先前活体组织检查的gleason分级(gg)考虑在内，其表示为1至5的整数。

11、根据另一个优选的实施方案，所提出方法包括：

12、如下进行的第一步骤：使所述对象的血清、血浆或血液、优选地在其稀释之后与每种蛋白质的至少一种亲和试剂接触、优选与每种蛋白质的两种亲和试剂接触，并检测在各蛋白质与所述至少一种亲和试剂之间是否发生结合，并使用各蛋白质之浓度的定量读出，从而允许计算在原始血清、血浆或血液中各自的浓度；

13、第二步骤：基于在第一步骤中确定的所有蛋白质浓度以及psa浓度来计算组合评分值。

14、在第二步骤之后，在第三步骤中，可基于如在第二步骤中确定的组合评分值来确定所述对象的pca手术之后bcr和/或者ap的风险，其中超过相应组合评分值阈值被视为在手术之后阳性bcr和/或视为需要前列腺切除术。

15、优选地，组合评分值基于所测量的浓度xtpsa、xmmp9、xlg3bp、xthbs1、xfn1、xlum和/或表示为1至5之整数的至少一个先前活体组织检查的gleason分级(gg)，使用下式以及β0、βtpsa、βgg、βmmp9、βlg3bp、βthbs1、βfn1、βlum来计算：

16、

17、优选地，参数选择如下，其中至少一个给定值或给定值的组合是可以的β0为(-2)至0，优选(-1.5)至(-0.5)；

18、βtpsa为0至0.4，优选0.01至0.31；

19、βgg为0.2至0.7，优选0.29至0.63；

20、βmmp9为0.00001至0.001，优选0.00018至0.00092；

21、βlg3bp为(-0.002)至0.0002，优选(-0.00021)至0.000022；

22、βthbs1为(-0.00004)至0.000007，优选(-0.000036)至0.0000068；

23、βfn1为(-0.000004)至0.00001，优选(-0.0000037)至0.0000011；

24、βlum为(-0.005)至0.03，优选(-0.00055)至0.0028。

25、根据本发明，优选地对于低bcr可能性，选择低于50或低于47.3，优选40.4至54.1的组合评分值阈值，对于中等bcr可能性，选择50至75或47.3至71.1，优选40.4至79.5的组合评分值的值，并且对于高bcr可能性，选择高于75或高于71.1，优选62.6至79.5的组合评分值阈值。

26、进一步优选地，对于在ap情况下90％的灵敏度，选择36，优选30至42的组合评分值阈值。

27、根据另一个优选的实施方案，该方法包括：

28、如下进行的第一步骤：使所述对象的血清、血浆或血液、优选地在其稀释之后与每种蛋白质的至少一种亲和试剂接触，并检测在各蛋白质与所述至少一种亲和试剂之间是否发生结合，并使用各蛋白质之浓度的定量读出，从而允许计算在原始血清、血浆或血液中各自的浓度，并且其中在该步骤中，使用优选具有可见读出的针对相应蛋白质具有特异性的夹心酶联免疫吸附测定，和/或优选具有荧光读出的针对相应蛋白质的基于珠的夹心抗体测定。

29、优选具有可见读出的针对相应蛋白质具有特异性的夹心酶联免疫吸附测定和/或优选具有荧光读出的针对相应蛋白质的基于珠的夹心抗体测定可以是通过分别使用人thbs1、lum、fn1、lg3bp、mmp9的重组蛋白质以及通过用其免疫接种动物产生的小鼠单克隆抗体获得的测定。

30、对所述各浓度的定量检测可包括相对于外部蛋白质标准品来确定这样的生物标志物的浓度，其包括通过测量数个蛋白质标准品、优选5至7个蛋白质标准品的确定浓度来制作参考标准曲线，所述蛋白质标准品用在对样品进行的同一组测量中测定的蛋白质稀释液相同的缓冲剂稀释。

31、本发明的另一些实施方案在从属权利要求中列出。