非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)生物标记及其用途的制作方法

发明领域本技术一般涉及生物标记的检测和非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的表征，例如，以便鉴别患有脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(nash)的受试者。在各种实施方案中，本发明涉及用于表征个体中的nafld和nash的一种或多种生物标记、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。

背景技术：

0、背景

1、以下描述提供了信息概要，并不是承认本文提供的任何信息或本文参考的任何出版物均为本技术的现有技术。

2、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)被定义为在酒精史不存在下，存在肝脂肪变性，伴有或不伴有炎症和纤维化。nafld被再分成非酒精性脂肪肝(nafl)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)。在nafl中，存在肝脂肪变性，但无明显的炎症证据，而在nash中，肝脂肪变性与肝脏炎症有关，其在组织学上不能与酒精性脂肪性肝炎相区分。

3、nafld已经在世界范围内流行并且在北美洲是肝脏疾病的主要原因，这是由于肥胖发病率的快速增加。然而，关于nafl和nash发病率的基于人群的精确数据是稀疏的，部分是由于诊断需要组织病理学文献。nafld的主要风险因素是向心性肥胖、2型糖尿病、血中的高甘油三酯(脂肪)水平和高血压。在美国，nafld存在于20-40％的人群中且nash存在于约25％的肥胖人群中。10至29％的nash患者发展成肝硬化，且其中4-27％发展成肝癌。

4、大多数患有nash的人没有症状。一些人可具有右上部疼痛、肝肿大或非特异性症状，如腹部不适、虚弱、疲劳或不舒服。医生或护士可由常规血液检查结果推测存在nash。在nafld中，肝酶天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)通常较高。

5、确认nash的当前黄金标准是肝活组织检查的组织评价，这项检查是昂贵的、侵入性的，且可导致疼痛、出血或甚至死亡。

6、非常需要能够鉴别并区分各个阶段的nafld和nash的简单血液检查(且由此减少对肝活组织检查的需要)。

技术实现思路

0、发明概述

1、在一些实施方案中，提供了确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的方法。在一些实施方案中，提供了鉴别患有脂肪变性的受试者的方法。在一些实施方案中，提供了确定脂肪变性的严重程度的方法。

2、在一些实施方案中，提供了确定受试者是否患有非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法。在一些实施方案中，提供了鉴别患有nash的受试者的方法。在一些实施方案中，提供了区分患有nash的受试者与患有脂肪变性的受试者的方法。在一些实施方案中，提供了确定nash的严重程度的方法。

3、在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(nafld)，包括由表15和/或表16中所列的生物标记蛋白形成具有n种生物标记蛋白的生物标记组，及在来自受试者的样品中检测该组的n种生物标记蛋白中的每一种的水平，其中n为至少5。在一些实施方案中，n为5至10，或n为6至10，或n为7至10，或n为8至10，或n为9至10，或n为至少6，或n为至少7，或n为至少8，或n为至少9。在一些实施方案中，n为5，或n为6，或n为7，或n为8，或n为9，或n为10。

4、在一些实施方案中，提供了确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的itga1/itgb1的水平，其中高于对照水平的itga1/itgb1的水平表明受试者患有nafld。在一些实施方案中，提供了一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的hsp90aa1/hsp90ab1的水平，其中高于对照水平的hsp90aa1/hsp90ab1的水平表明受试者患有nafld。在一些实施方案中，提供了一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的itga1/itgb1和hsp90aa1/hsp90ab1的水平，其中高于对照水平的itga1/itgb1的水平和/或hsp90aa1/hsp90ab1的水平表明受试者患有nafld。在一些实施方案中，所述方法还包括在来自受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种选自以下的生物标记的水平：acy1、c7、colec11、csf1r、dcn、kynu、por和thbs2，其中高于相应生物标记的对照水平的选自acy1、c7、colec11、csf1r、dcn、kynu、por和thbs2的至少一种生物标记的水平表明所述受试者患有nafld。在一些实施方案中，所述方法包括检测itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1、acy1、colec11和thbs2的水平。在一些实施方案中，所述方法包括测定受试者中的ast水平，其中升高的ast水平表明所述受试者患有nafld。

5、在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(nafld)，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或十一种选自以下的生物标记的水平：acy1、c7、colec11、csf1r、dcn、hsp90aa1/hsp90ab1、itga1/itgb1、kynu、por、fcgr3b、lgals3bp、serpinc1、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和thbs2，其中高于相应生物标记的对照水平的至少一种选自acy1、c7、colec11、csf1r、dcn、hsp90aa1/hsp90ab1、itga1/itgb1、kynu、por、fcgr3b、lgals3bp、serpinc1、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和thbs2的生物标记的水平表明所述受试者患有nafld。在一些实施方案中，所述方法包括检测hsp90aa1/hsp90ab1或itga1/itgb1、或hsp90aa1/hsp90ab1和itga1/itgb1两者的水平。

6、在本文所述的任一实施方案中，所述方法包括确定受试者是否患有脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化。

7、在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有脂肪变性，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种选自以下的生物标记的生物标记组：acy1、kynu、itga1/itgb1、por、hsp90aa1/hsp90ab1、thbs2和csf1r；检测来自受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定受试者是否患有脂肪变性或确定受试者患脂肪变性的可能性。

8、在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有脂肪变性，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种选自以下的生物标记：acy1、kynu、itga1/itgb1、por、hsp90aa1/hsp90ab1、thbs2和csf1r，以便确定所述受试者是否患有脂肪变性或确定受试者患脂肪变性的可能性。

9、在一些实施方案中，所述生物标记组包含acy1、knyu及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：itga1/itgb1、por、hsp90aa1/hsp90ab1、thbs2和csf1r。

10、在一些实施方案中，所述方法包括检测acy1、knyu及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：itga1/itgb1、por、hsp90aa1/hsp90ab1、thbs2和csf1r。在一些实施方案中，所述方法包括检测至少一种选自以下的生物标记：itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1和csf1r。在一些实施方案中，所述方法包括检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种选自以下的生物标记：acy1、itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1、por、thbs2和kynu。

11、在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有小叶炎症，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：acy1、thbs2、colec11、itga1/itgb1、csf1r、kynu、fcgr3b和por；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有小叶炎症或确定受试者患小叶炎症的可能性。

12、在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有小叶炎症，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记：acy1、thbs2、colec11、itga1/itgb1、csf1r、kynu、fcgr3b和por，以便确定所述受试者是否患有小叶炎症或确定受试者患小叶炎症的可能性。

13、在一些实施方案中，生物标记组包含acy1、thbs2、colec11及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：itga1/itgb1、csf1r、kynu、fcgr3b和por。

14、在一些实施方案中，所述方法包括检测acy1、thbs2、colec11及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：itga1/itgb1、csf1r、kynu、fcgr3b和por。在一些实施方案中，所述方法包括检测itga1/itgb1。

15、在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有肝细胞气球样变性，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：acy1、colec11、thbs2、itga1/itgb1、c7、por、lgals3bp和hsp90aa1/hsp90ab1；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定受试者患肝细胞气球样变性的可能性。

16、在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有肝细胞气球样变性，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记：acy1、colec11、thbs2、itga1/itgb1、c7、por、lgals3bp和hsp90aa1/hsp90ab1，以便确定所述受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定受试者患肝细胞气球样变性的可能性。

17、在一些实施方案中，生物标记组包含acy1、colec11、thbs2及至少一种或两种选自itga1/itgb1和hsp90aa1/hsp90ab1的另外的生物标记。

18、在一些实施方案中，所述方法包括检测acy1、colec11、thbs2及至少一种或两种选自itga1/itgb1和hsp90aa1/hsp90ab1的另外的生物标记。

19、在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有纤维化，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记的生物标记组：c7、colec11、thbs2、itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1、acy1、csf1r、kynu、por、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和dcn；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定受试者患纤维化的可能性。

20、在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有纤维化，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记：c7、colec11、thbs2、itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1、acy1、csf1r、kynu、por、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和dcn，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定受试者患纤维化的可能性。

21、在一些实施方案中，生物标记组包含c7、colec11、thbs2及至少一种、至少两种或三种选自以下的另外的生物标记：itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1和dcn。

22、在一些实施方案中，所述方法包括检测c7、colec11、thbs2及至少一种、至少两种或三种选自以下的另外的生物标记：itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1和dcn。

23、在本文所述的任一实施方案中，所述受试者处于发展脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的风险中。

24、在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可处于发展nafld的风险中。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可处于发展脂肪变性的风险中。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可处于发展nash的风险中。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可具有选自以下的nafld合并症：肥胖、腹部肥胖、代谢综合征、心血管疾病和糖尿病。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可为肥胖的。

25、在本文所述的任一实施方案中，至少一种生物标记可为蛋白质生物标记。在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记可为蛋白质生物标记。在一些实施方案中，一种方法包括使来自所述受试者的样品的生物标记与一组生物标记捕获试剂接触，其中该组生物标记捕获试剂中的每种生物标记捕获试剂特异性地结合至被检测的不同生物标记。在一些实施方案中，每种生物标记捕获试剂为抗体或适体。在一些实施方案中，每种生物标记捕获试剂为适体。在一些实施方案中，至少一种适体为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

26、在本文所述的任一实施方案中，所述样品可为血液样品。在本文所述的任一实施方案中，所述样品可选自血清样品和血浆样品。

27、在本文所述的任一实施方案中，如果受试者患有nafld或nash，那么可向所述受试者推荐选自减轻体重、控制血糖和避免酒精的方案。在本文所述的任一实施方案中，如果受试者患有nafld或nash，那么可向所述受试者推荐胃旁路手术。在本文所述的任一实施方案中，如果受试者患有nafld或nash，那么可向所述受试者开出至少一种选自吡格列酮、维生素e和二甲双胍的治疗剂的处方。

28、在一些实施方案中，本文所述的方法是出于确定医疗保险费或人寿保险费的目的。在一些实施方案中，方法还包括确定医疗保险费或人寿保险费。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使用由所述方法得到的信息来预测和/或管理医疗资源的利用。

29、在一些实施方案中，提供了试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或十一种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、c7、colec11、csf1r、dcn、hsp90aa1/hsp90ab1、itga1/itgb1、kynu、por、fcgr3b、lgals3bp、serpinc1、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和thbs2。

30、在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、kynu、itga1/itgb1、por、hsp90aa1/hsp90ab1、thbs2和csf1r。

31、在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、thbs2、colec11、itga1/itgb1、csf1r、kynu、fcgr3b和por。

32、在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、colec11、thbs2、itga1/itgb1、c7、por、lgals3bp和hsp90aa1/hsp90ab1。

33、在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：c7、colec11、thbs2、itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1、acy1、csf1r、kynu、por、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和dcn。在本文的任一实施方案中，每种适体结合至不同的靶蛋白。

34、在本文所述的任一实施方案中，至少一种适体可为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，每种适体可为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有疏水性修饰的核苷酸。

35、在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

36、在一些实施方案中，提供了组合物。在一些这类实施方案中，组合物包含来自受试者的样品的蛋白质及至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或十一种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、c7、colec11、csf1r、dcn、hsp90aa1/hsp90ab1、itga1/itgb1、kynu、por、fcgr3b、lgals3bp、serpinc1、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和thbs2。

37、在一些实施方案中，组合物包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、kynu、itga1/itgb1、por、hsp90aa1/hsp90ab1、thbs2和csf1r。

38、在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、thbs2、colec11、itga1/itgb1、csf1r、kynu、fcgr3b和por。

39、在一些实施方案中，每种适体结合至不同的靶蛋白。

40、在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：acy1、colec11、thbs2、itga1/itgb1、c7、por、lgals3bp和hsp90aa1/hsp90ab1。

41、在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：c7、colec11、thbs2、itga1/itgb1、hsp90aa1/hsp90ab1、acy1、csf1r、kynu、por、igfbp7、pik3ca/pik3r1、nagk、ddc、serpina7和dcn。

42、在一些实施方案中，每种适体特异性地结合至不同的靶蛋白。

43、在本文所述的任一实施方案中，所述样品可为血液样品。在本文所述的任一实施方案中，所述样品可选自血清样品和血浆样品。

44、在本文所述的任一实施方案中，至少一种适体可为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，每种适体可为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有疏水性修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

45、在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记可为蛋白质生物标记。在本文所述的任一实施方案中，所述方法可包括使来自所述受试者的样品的生物标记与一组生物标记捕获试剂接触，其中该组生物标记捕获试剂中的每种生物标记捕获试剂特异性地结合至被检测的生物标记。在一些实施方案中，该组生物标记捕获试剂中的每种生物标记捕获试剂特异性地结合至被检测的不同生物标记。在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记捕获试剂可为抗体或适体。在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记捕获试剂可为适体。在本文所述的任一实施方案中，至少一种适体可为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，至少一种慢解离速率适体可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰是疏水性修饰。在一些实施方案中，所述修饰是疏水性碱基修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可选自图11中所示的修饰。在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

46、在本文所述的任一实施方案中，所述样品可为血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品选自血清样品和血浆样品。

47、在本文所述的任一实施方案中，组合物中的样品可为血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品选自血清样品和血浆样品。

48、在本文所述的任一实施方案中，试剂盒或组合物可包含至少一种适体，其为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，试剂盒或组合物的每种适体可为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，至少一个具有修饰的核苷酸是具有疏水性碱基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每个具有修饰的核苷酸是具有疏水性碱基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每个疏水性碱基修饰独立地选自图11中的修饰。在一些实施方案中，试剂盒中的每种慢解离速率适体以如下解离速率(t1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。