N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法与流程

本发明属于分析领域，具体涉及n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法。

背景技术：

1、环肽能够以高亲和力和靶标特异性与蛋白质靶标结合，因此是对于治疗剂开发有吸引力的分子类别。事实上，临床上已经成功使用了几种环肽，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制剂环孢霉素或抗癌药奥曲肽(driggers等人(2008),nat rev drug discov 7(7),608-24)。良好的结合特性是由于肽与靶标之间形成的相对较大的相互作用表面以及环状结构的构象柔韧性降低所致。

2、双环肽既具备类似小分子药物的药理学特性，又具有类似抗体药物的靶向性。双环肽大概由9到15个氨基酸组成，分子量约为1.5-2kda，因此具有类似小分子药物的灵活给药途径和快速组织渗透力。双环肽可以通过肾脏代谢清楚，对肝脏和肠道的潜在毒性较小，减少对病人生理功能的不良影响。

3、双环肽的结构使得多个肽能够以高亲和力和选择性与靶标蛋白结合，且未发现有免疫原性。多数肽结构以多重折叠的状态存在，其中只有少数能够与靶蛋白结合。

4、双环肽通过3个半胱氨酸的3个-sh基团与骨架分子tata生成共价键，形成双环肽结构。如果未环化完全，即有巯基与骨架分子tata未形成共价键从而产生未完全环化杂质。而该类杂质与环化完全的主产物分子量完全相同，液相和质谱均无法分离。

5、目前尚未有相关技术。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了n乙基马来酰亚胺(即nem)标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，本发明通过n乙基马来酰亚胺与游离巯基反应，标记后的带1个游离巯基杂质、带两个游离巯基杂质分子量分别与主峰分子量相差125da,250da，通过lc-ms检测可检测到样品中游离巯基杂质情况。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供了n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，所述方法包括通过n乙基马来酰亚胺与双环肽的游离巯基反应进行标记，标记后的双环肽带有1个游离巯基杂质以及带有两个游离巯基杂质分子量使得标记后的双环肽与主峰分子量不同，再通过lc-ms检测，检测到样品中游离巯基杂质的情况。

4、作为本发明的一种优选方案，标记后的双环肽带有1个游离巯基杂质与主峰分子量相差125da，标记后的双环肽带有两个游离巯基杂质分子量与主峰分子量相差250da。

5、作为本发明的一种优选方案，所述方法包括以下步骤：

6、1)配制n乙基马来酰亚胺溶液：称取n乙基马来酰亚胺置于容器中，加入乙腈溶解，得到浓度为1mg/ml的n乙基马来酰亚胺溶液；

7、2)配制双环肽溶液：称取100μl浓度为5mg/ml的双环肽溶液放置于1.5ml离心管中，加入900μl超纯水，得到浓度为0.5mg/ml的双环肽溶液；

8、3)样品处理：称取步骤2)得到的浓度为0.5mg/ml的双环肽溶液100μl，加入步骤1)得到的n乙基马来酰亚胺溶液，孵育一段时间以充分进行标记；

9、4)通过lc-ms检测，并处理数据。

10、作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，加入的n乙基马来酰亚胺溶液的体积为125μl；孵育的温度为37℃，孵育时间为20min。

11、作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，检测条件为：dad检测器波长：260nm；流速：0.6ml/min；柱温：40℃；自动进样器温度：10℃；进样量：10μl。

12、作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，检测时的流动相a为含0.1％三氟乙酸，流动相b为乙腈。

13、作为本发明的一种优选方案，流动相配比为：0min，90％流动相a：10％流动相b；2min，90％流动相a：10％流动相b；30min，10％流动相a：90％流动相b；31min，90％流动相a：10％流动相b；35min，90％流动相a：10％流动相b。

14、作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，色谱柱为agilent zorbax eclipse xdb-c18，色谱柱的长度为150mm，宽度为4.6mm，填料粒径为5μm。

15、本发明采用上述方案，具有以下有益效果：

16、1)本发明通过n乙基马来酰亚胺与游离巯基反应，通过lc-ms检测可检测到样品中游离巯基杂质情况，可以有效分离和检测出单体物料中杂质。

17、2)本发明的方法分离效果好，简单方便。

技术特征：

1.n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，所述方法包括通过n乙基马来酰亚胺与双环肽的游离巯基反应进行标记，标记后的双环肽带有1个游离巯基杂质以及带有两个游离巯基杂质分子量使得标记后的双环肽与主峰分子量不同，再通过lc-ms检测，检测到样品中游离巯基杂质的情况。

2.根据权利要求1所述的n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，标记后的双环肽带有1个游离巯基杂质与主峰分子量相差125da，标记后的双环肽带有两个游离巯基杂质分子量与主峰分子量相差250da。

3.根据权利要求1所述的n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤3)中，加入的n乙基马来酰亚胺溶液的体积为125μl；孵育的温度为37℃，孵育时间为20min。

5.根据权利要求3所述的n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤4)中，检测条件为：dad检测器波长：260nm；流速：0.6ml/min；柱温：40℃；自动进样器温度：10℃；进样量：10μl。

6.根据权利要求3所述的n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤4)中，检测时的流动相a为含0.1％三氟乙酸，流动相b为乙腈。

7.根据权利要求6所述的n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，流动相配比为：0min，90％流动相a：10％流动相b；2min，90％流动相a：10％流动相b；30min，10％流动相a：90％流动相b；31min，90％流动相a：10％流动相b；35min，90％流动相a：10％流动相b。

8.根据权利要求3所述的n乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤4)中，色谱柱为agilent zorbax eclipse xdb-c18，色谱柱的长度为150mm，宽度为4.6mm，填料粒径为5μm。

技术总结
本发明公开了N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，所述方法包括通过N乙基马来酰亚胺与双环肽的游离巯基反应进行标记，标记后的双环肽带有1个游离巯基杂质以及带有两个游离巯基杂质分子量使得标记后的双环肽与主峰分子量不同，再通过LC‑MS检测，检测到样品中游离巯基杂质的情况。本发明通过N乙基马来酰亚胺与游离巯基反应，通过LC‑MS检测可检测到样品中游离巯基杂质情况，分离效果好，简单方便。

技术研发人员：侯丽强,刘婷,窦文科,安婷婷
受保护的技术使用者：杭州诺泰诺和生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13