基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器及其制备方法和应用

本发明涉及生物电化学传感器，具体涉及基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、外泌体（exosomes）是一种尺寸比较小的细胞外囊泡，大小在30-150 nm左右，来源于多囊泡内体，并且在多囊泡体与质膜融合时被积极分泌。肿瘤微环境由癌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和特定实质内的免疫细胞等多种细胞组成。已有研究表明，癌细胞可以通过释放纳米级细胞外囊泡即外泌体，以分泌方式影响肿瘤生态内的其他细胞，从而加速肿瘤块的生长，并且具有显著信息的外泌体可以反映亲本肿瘤细胞代谢和蛋白质组谱的任何变化。因此，可以通过检测外泌体的相关信息来预测肿瘤的发生。另外，外泌体的膜上有许多不同的膜蛋白，这些蛋白可以作为肿瘤产生和繁殖的标志物，因此，对肿瘤细胞来源的外泌体的分析检测在基础研究、临床诊断和分子治疗等多个方面具有重要的潜在应用价值。

2、外泌体可以利用抗体或核酸适配体的识别作用靶向表面蛋白质，结合多种方法如比色法、荧光法、表面增强拉曼法，但这些方法需要用到大型仪器，价格昂贵，耗时长。电化学方法具有仪器设备简单，价格低廉等优点，但灵敏度不高，为了提高检测的灵敏度，通常会进行一些信号扩增，常见的信号扩增主要为利用内切酶的循环扩增，酶聚合链反应，dna的链式杂交或使用纳米材料作为载体负载更多的信号分子，但酶等生物分子的使用会提高造价且受环境的影响较大，容易失活。纳米材料如au、pd等贵金属材料具有很好的生物相容性和催化活性，但由于外泌体本身导电性差，会影响其催化活性，从而影响检测的灵敏度。因此如何更好的提高检测的灵敏度是实现外泌体有效检测急需解决的问题。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的外泌体检测繁琐耗时、选择性差、灵敏度低、成本高等缺点，本发明提供了一种基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器，并建立一种基于等离子体共振（lspr）检测肿瘤细胞外泌体的方法，能够快速、高效的检测检测到肿瘤细胞外泌体，而且灵敏度高、重现性好、操作简单、成本低廉。

2、本发明的另一目的是提供所述肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器的制备方法和应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器，所述电化学传感器包括电极、具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥、双适配体和核酸探针，所述具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥修饰在电极表面，所述双适配体通过核酸探针固定在修饰了具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥电极表面，其组成为dual-aptamer/probe/pta nbps/电极。

4、其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，所述双适配体为含有可以特异性识别ccrf-cem肿瘤细胞中过表达的膜蛋白（ptk7）的适配体。

5、进一步地，所述双适配体为含有同一种的适配体的两种不同的dna链，可以互相杂交形成双适配体，所述双适配体不限于可以特异性识别ccrf-cem肿瘤细胞中过表达的膜蛋白（ptk7）的适配体，不同双适配体序列，可以得到识别其他膜蛋白的双适配体。

6、其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，所述核酸探针为可以与双适配体杂交的且可以固定在pd-au异质结构纳米双锥上的dna序列。

7、其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥为具有表面等离子共振效应的双金属异质结构纳米材料。

8、其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，所述电极为玻碳电极、金电极、铂电极、热解石墨电极或ito电极中的任意一种。

9、本发明所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：

10、（1）制备金种子将其加入到生长液中形成au nbps溶液，离心分散到ctac溶液中，随后加入agno3和抗坏血酸混合均匀，将混合溶液油浴加热形成au nbp@ag纳米结构，再次离心后分散到ctab溶液中，加入四氯合钯（ii）酸和抗坏血酸，在au nbps尖端形成金属纳米颗粒pd，得到具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥pta nbps；

11、（2）在电极上修饰具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥pta nbps，形成ptanbps电极，取含核酸探针probe dna的缓冲液滴到pta nbps电极上在室温下封闭，获得probe/pta nbps/电极，将probe/pta nbps/电极浸泡在含有双适配体dual-aptamer的杂交缓冲液中，反应形成dual-aptamer /probe/pta nbps/电极，即为对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器。

12、作为优选，将10 μl 0.5 μm probe dna滴到pta nbps/gc电极上，并在4 ℃条件下组装13 h，以金-硫键的方式连接到pta nbps/gc电极表面。

13、进一步地，电极在50 μl dual-aptamer杂交缓冲液浸泡，然后和不同浓度的外泌体在37 °c孵育，每一步结束后，用pbs清洗修饰后的电极，洗脱非特异性吸附的物质。

14、本发明所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器在检测肿瘤细胞外泌体中的应用。

15、其中，所述应用过程为：将制备对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器浸泡在含肿瘤细胞外泌体悬液中进行孵育反应捕获外泌体，在近红外激光的照射下测试不同已知外泌体浓度的光电流信号。

16、其中，所述近红外激光的照射波长可根据纳米材料尺寸在500-1064 nm进行调节，功率密度为100-1500 mwcm-2。

17、优选的，近红外激光的照射所引起的lspr效应可增强pd-au异质结构纳米双锥电催化活性，所述近红外激光的照射波长为808 nm，功率密度为500 mwcm-2。

18、其中，所述外泌体浓度为1.6×103-3.0×106 particles μl-1，室温孵育反应时间为100-120 min。

19、优选的，所述外泌体浓度为1.6×103，3.0×103，6.0×103，1.0×104，3.0×104，6.0×104，1×105，6.0×105，1.0×106，3.0×106 particles μl-1。

20、本发明所述一种检测肿瘤细胞外泌体的电化学传感器，其中以抗坏血酸（aa）为电化学活性探针，捕获探针dna链（probe）及双适配体dna链（dual-aptamer）作为识别元素，其中probe链通过巯基（金-硫键）修饰在pta nbps/gc电极表面，基于适配体对于外泌体表面蛋白的特异性识别，可以更加精准的将外泌体捕获到电极表面。在近红外激光的照射下记录不同外泌体浓度下的电化学信号。其中，采用1 mm aa作为电活性探针，所用激光波长为808 nm，功率密度为500 mwcm-2。

21、本发明制备的电化学传感器中使用了具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥（pta nbps），所述的pta nbps，其粒径大小约为100 nm。

22、本发明所述的检测外泌体的电化学传感器进行检测时，在chi 760c电化学工作站（上海，中国）上采用循环伏安法（cv）和安培曲线（ i-t）对电化学信号进行记录；所述本发明制备的传感器作为工作电极，参比电极为饱和甘汞（hg/hg2cl2），辅助电极为铂（pt）。采用安培曲线（ i-t）记录不同外泌体浓度的光电流值，建立不同浓度外泌体与电化学响应信号工作曲线。

23、本发明中在玻碳电极（gc）上修饰具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥（ptanbps）等离子体后，将双适配体通过探针dna固定在等离子体pta nbps表面，通过双适配体对于同一外泌体表面蛋白的特异性识别，可以更加精准的捕获到外泌体。在局域表面等离子体共振（lspr）的激发下，由于热电子从pta nbps到外部电路的高效传输，电化学电流响应显著增强。在pta nbps表面捕获的外泌体会影响热电子传输效率，导致电流响应降低。通过使用抗坏血酸（aa）作为电活性探针，发现pta nbps/gc电极在光照下的电流响应随外泌体浓度的增加而减小。由于双适配体的精准特殊分子识别与等离子体元的电化学性能增强，所提出的方法能够实现具有优异选择性的简单且灵敏的电化学检测。实验结果表明，该生物电化学传感器对于ccrf-cem细胞外泌体的检出限为430 particles μl-1，线性范围为：1.6×103-1.0×106particles μl-1。并且该生物传感器具有很好的选择性，能够对区分含有不同量的ptk7蛋白的外泌体，实现了含有ptk7蛋白的外泌体的选择性检测。本发明的基于lspr电化学传感器在生物分析和早期临床诊断方面具有广阔的应用前景。

24、本发明首先合成具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥（pta nbps）；通过评价所制备的pta nbps的等离子体共振电化学性能，并通过适配体与外泌体作用，发现在ptanbps表面捕获的外泌体会影响热电子传输效率，导致光电流响应猝灭，进而提出一种基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器及其定量检测的方法。

25、具体方法包括如下步骤：

26、（1）电化学传感器的制备

27、在玻碳电极上修饰具有各向异性的pd-au异质结构纳米双锥（pta nbps）等离子体后，将双适配体通过探针dna固定在等离子体pta nbps/gc电极表面，通过双适配体对于同一外泌体双蛋白的特异性识别，可以精准的捕获到外泌体。

28、（2）癌细胞来源外泌体的检测

29、以抗坏血酸（aa）作为电活性探针，首先测试pta nbps/gc电极在光照时的稳态电流，接着通过所组装的电极捕获外泌体，测试不同已知外泌体浓度的光电流信号。

30、（3）拟合工作曲线

31、将记录的光电流值绘制成不同外泌体浓度的对数与光电流强度变化曲线图，将其中线性部分拟合并得出拟合公式。

32、（4）不同癌细胞来源外泌体的检测

33、在同一浓度下，取不同癌细胞来源的外泌体，每个样品用六根电极做平行试验，操作步骤如上述（1）和（2），实现对不同细胞来源的外泌体的检测分析。

34、采用本发明的电化学传感器以及上述外泌体的检测方法，其线性范围为1.6×103- 1.0×106particles μl-1；检测限为430 particles μl-1。

35、所述方法中，步骤（1）所述的pta nbps，其粒径大小约为100 nm。

36、优选地，所述方法中，步骤（2）（4）中捕获外泌体的最佳温度为37 °c，最佳时间为120 min。

37、进一步地，所述外泌体为ccrf-cem肿瘤细胞来源的外泌体。

38、所述方法中，步骤（1）（2）（4）中，电化学活性物质为抗坏血酸（aa），信号记录方式为安培曲线（ i-t）。

39、所述方法中，步骤（1）（2）（4）中所用到的激光器的波长为808 nm，功率密度为500mwcm-2。

40、所述方法中，步骤（3）中记录电化学响应信号以未含外泌体的响应信号为 i0，含有外泌体的标样的响应信号为 ii，响应信号的差值δ i定义为未含外泌体的响应信号 i0减去含有外泌体标样的响应信号 i0（δ i= i0 – ii）；将所述的δ i与外泌体的浓度的对数lg c（ c是外泌体的浓度）绘制成δ i-lg c工作曲线，再采用线性回归法得到δ i-lg c线性回归方程，建立基于外泌体对pta nbps等离子体共振产生光电流信号淬灭作用的外泌体检测工作曲线。

41、工作原理：首先在玻碳电极上修饰等离子体pta nbps，在lspr的激发下，由于热电子从pta nbps到外部电路的高效传输，电化学电流响应显著增强。基于双适配体对于外泌体表面蛋白的特异性识别，可以更加精准的将外泌体捕获到电极表面，在pta nbps表面捕获的肿瘤细胞的外泌体会影响热电子传输效率，导致电流响应降低。通过使用抗坏血酸（aa）作为电活性探针，发现pta nbps/gc电极在光照下的电流响应随肿瘤细胞的外泌体浓度的增加而减小，从而实现电化学传感器的灵敏电化学信号转导及其定量关系构建。

42、设计原理：本发明提出利用具有局域表面等离子体共振效应（lspr）的pd-au异质结构纳米双锥（pta nbps）来构建生物传感器，在近红外光的照射下，实现热载流子的分离和利用，可以更有效的提高贵金属材料的催化活性。本发明中合成了特定的pta nbps，ptanbps是一种异质纳米结构等离子体材料，等离子体纳米粒子与过渡金属pd杂交可以避免能量障碍的形成，增加热载流子的分离和利用，它具有很好的lspr效应，并且该材料具有很好的生物相容性和导电性，通过使用抗坏血酸（aa）作为电活性探针，结合适配体的识别作用，建立了一种基于lspr增强信号的外泌体高灵敏电化学检测方法。本发明在玻碳电极上修饰具有各向异性的pta nbps等离子体后，将双适配体通过探针（probe）固定在pta nbps表面，probe可以将双适配体连接到电极表面，双适配体是两条dna链，其都含有同一种适配体，将其杂交起来，两个相同的适配体在两端，和单适配体相比较，与目标物的结合更准确且牢固。通过双适配体对于同一外泌体蛋白的特异性识别，可以精准的捕获到外泌体。没有外泌体存在的条件下，在lspr的激发下，热电子从pta nbps高效传输到外部电路 aa的电化学电流响应显著增强。在外泌体存在的情况下， pta nbps表面捕获的外泌体会影响热电子传输效率，导致电流响应降低。电流的降低与外泌体浓度有关，从而可以实现肿瘤外泌体的定量检测。

43、本发明利用双金属异质纳米结构lspr的特性，构建基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器，实现对肿瘤外泌体高灵敏无标签的检测。在本发明中，只需利用外泌体对在lspr激发下的pta nbps/gc产生光电流的猝灭，不需要修饰任何信标分子，就可以实现对肿瘤细胞外泌体高灵敏无标签的检测。

44、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

45、（1）本发明通过双适配体结构可以增加捕获到外泌体的概率，同时也可以使得适配体与外泌体之间结合的更加牢固，从而增加对外泌体检测的检出限与灵敏度。在局域表面等离子体共振的激发下，由于双适配体的精准特殊分子识别与等离子体元的电化学性能增强，所提出的传感器和检测方法能够实现具有优异选择性的简单且灵敏的电化学检测。该检测过程简单方便，速度快，成本低，灵敏度高，选择性强，稳定性好等优点；检测范围较宽其线性范围为1.6×103-1.0×106particles μl-1；检测限为430 particles μl-1。

46、（2）在本发明中，利用双金属异质纳米结构lspr的特性，构建基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器，将贵金属纳米粒子lspr效应应用于外泌体电化学检测中，实现对肿瘤外泌体高灵敏无标签的检测。在现有对外泌体检测技术中，很多都需要修饰信标分子，或者通过一些酶辅助反应过程，这样会使得过程繁琐，价格昂贵，在本发明中，只需利用外泌体对在lspr激发下的pta nbps/gc产生光电流的猝灭，不需要修饰任何信标分子，就可以实现对肿瘤细胞外泌体高灵敏无标签的检测。

47、（3）在本发明的检测方法中，所述的方法既操作简单，不需要昂贵的仪器，又具有优异的选择性。本发明传感器制备简单、使用方便，制备传感器时仅仅是通过probe将双适配体连接到电极表面，然后将外泌体与组装后的电极孵育，双适配体可以特异性识别外泌体上的蛋白从而精准的捕获到外泌体。本发明构建的生物电化学传感器可以方便、简洁地对癌细胞外泌体进行定量检测，使用双适配体代替单适配体与目标物结合，提高了系统的灵敏度和稳定性。

48、（4）本发明利用等离子体元的电化学性能增强以及双适配体的特异性识别，能够实现超灵敏和无标记的外泌体检测，具有优异的选择性，同时本发明构建的生物电化学传感器利用双适配体，不易受外界环境因素（如温度、ph）的影响。