一种双切刻酶驱动的双自由足DNA步行者生物传感器及其制备方法和应用

本发明涉生物，具体涉及了一种双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、阿尔兹海默病(alzheimer’s disease，ad)是一种最常见的神经退行性疾病，临床表现为进行性记忆丧失、认知功能受损、日常活动困难，给社会和家庭带来了严重的经济压力和护理负担。ad作为一种进行性的神经系统疾病，诊断的滞后性给治疗带来了很大的障碍。因此，发展可靠和高效的早期诊断技术对于ad的早期诊断和治疗是非常迫切的。

2、ad的临床诊断主要依靠病理切片、正电子发射断层扫描(positronemissiontomography，pet)、分子生物标志物检测等。研究人员已经确定ad患者体液中的分子生物标记物是诊断和治疗的有效靶点，因为它们具有性质稳定、出现早、可无创获取等特点。临床研究表明，淀粉样蛋白β(amyloidβ，aβ)和tau在ad中具有协同作用，aβ聚集导致大量突触丢失，tau的异常修饰阻碍神经元的正常通讯，导致ad患者的记忆丧失和认知障碍。研究表明，几乎所有ad患者的脑脊液和血清中aβo和tau的表达水平都增加。因此，aβo和tau均成为诊断和治疗ad最有希望的靶点，对它们精准分析可用于ad的早期诊断。为此，近年来研究人员开发了各种生物传感器，包括比色、荧光、电化学和电化学发光传感器等。尽管这些传感器已经用于ad的分析，但是单独aβo或tau检测仍然具有可靠性和准确性不足的缺点。制备aβo和tau联合分析的平台是解决上述问题的有效途径。

3、电化学传感器因其灵敏度高、界面组装灵活、操作简单等优点已广泛应用于疾病生物标志物的检测。此外，模拟生物蛋白质马达的dna步行者是一种能够在纳米尺度上自主执行机械运动的分子机器，在制备的生物传感器中显示出强大的识别和信号放大能力。对于蛋白质响应型生物传感器，通常将蛋白质亲和序列整合到dna步行者中，用于目标识别和信号转导。然而，残留在界面上的靶蛋白可能会对dna步行者的移动造成空间位阻，并且固定在界面上的dna步行者摆臂运动范围有限，不能充分发挥其信号放大能力。

4、然而传统界面锚定的dna步行器通常具有固定的摆臂范围和预设轨道，这使得传感器系统变的复杂，限制了在更多场景的应用。

5、目前，缺乏一种双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法及其应用。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种灵敏检测的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器及其制备方法和应用。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

3、(1)将生物素化的aβo适配体t1与aβo dna步行者w1按摩尔比为1：1的比例混合，形成dsdnat1w1，

4、将生物素化的tau适配体t2与tau dna步行者w2按摩尔比为1：1的比例混合，形成dsdna t2w2，

5、strep-mb与t1w1和t2w2结合形成具有识别和捕获功能的纳米颗粒；在aβo和tau存在的情况下，由于适配体t生物素化的aβo适配体t1和生物素化的tau适配体t2与aβo和tau的竞争性结合，aβo dna步行者w1和taudna步行者w2在动力学竞争下被释放；

6、(2)aβo dna步行者w1和tau dna步行者w2可以与金电极表面携带有亚甲基蓝mb的aβo锚定链a1和携带二茂铁fc的tau锚定链a2杂交，形成含有nt.a1wi和nb.bbvci切割位点的dsdna，制得双切刻酶驱动的自由足dna步行者生物传感器。

7、进一步地，在步骤(1)中，所述的生物素化的aβo适配体t1的基因序列为seq idno.1所示的核苷酸序列；所述的生物素化的tau适配体t2的基因序列为seq id no.2所示的核苷酸序列；所述的aβo dna步行者w1的基因序列为seq id no.3所示的核苷酸序列；所述的tau dna步行者w2的基因序列为seq id no.4所示的核苷酸序列。

8、进一步地，在步骤(1)中，以终浓度为1μm将t1，w1和t2，w2按摩尔比为1:1:1:1混合，在温度为37℃孵育1h形成dsdna t1w1和t2w2。

9、更进一步地，在步骤(2)中，将携带mb标签的a1和携带fc标签的a2以终浓度为1μm滴加在金电极表面，在温度为4℃孵育8h。检测仪器：检测电化学电流和电化学阻抗，电化学工作站，ch厂家，仪器名称：chi760。

10、进一步地，在步骤(2)中，aβo锚定链a1中携带mb标签，tau锚定链a2中携带fc标签，mb标签和fc标签通过切刻酶切割从金电极的表面移除，重新获得自由的双足dna步行者继续在电极表面上移动，产生循环扩增效应；因此，当加入aβo和tau时dna步行者w链被释放，在切刻酶的辅助下，在电极表面循环切割底物，产生放大的电化学信号。

11、进一步地，在步骤(2)中，将0.5μlnt.a1wi与0.5μl nb.bbvci与经磁分离的w链同时滴加在金电极37℃时反应，反应时间为1h。

12、本发明所述的制备方法制得的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器。

13、本发明所述的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器在检测阿尔兹海默病相关生物标志物中的应用。

14、有益效果：本发明的传感器不仅可以同时灵敏检测aβo和tau，而且以相互补充的方式使ad的诊断更加精准。

15、与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明的一种电化学传感器，以电极作为反应界面，利用双切刻酶供能的双自由足dna步行者实现信号放大，用于aβo和tau的灵敏分析。首先，通过功能性磁珠(functional magnetic beads，mbs)上的生物素化适体与aβo和tau之间的竞争性结合作用来释放dna双足。然后，游离的dna两足在双切刻酶的辅助下在电极表面上行走，并从电极表面释放aβo和tau的底物，产生一对多的信号放大效应。

16、(2)本发明制备的传感器在临床样本中检测aβo和tau获得了令人满意的准确性和可靠性。本发明为ad的精准早期诊断提供了一个有竞争力的工具，诊断阿尔兹海默病(区分ad与正常人)，并在未来可能具有广泛的应用前景。

17、(3)在该方法中，双功能的磁纳米颗粒用于识别和捕获aβ寡聚物(aβoligomer，aβo)和tau，并释放游离的双足dna步行者。当dna步行者在电极表面自由移动时，nt.a1wi和nt.bbvci循环切割双链dna并释放两种底物链，产生显著的信号放大。此外，已经证实该方法可以在实际样本中区分正常人和ad患者。该生物传感器优异的性能使其在临床诊断ad患者和预后评估中更有应用前景。

技术特征：

1.一种双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的生物素化的aβo适配体t1的基因序列为seq id no.1所示的核苷酸序列；所述的生物素化的tau适配体t2的基因序列为seq id no.2所示的核苷酸序列；所述的aβo dna步行者w1的基因序列为seq id no.3所示的核苷酸序列；所述的tau dna步行者w2的基因序列为seq id no.4所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，以终浓度为1μm将t1，w1和t2，w2按摩尔比为1:1:1:1混合，在温度为37℃孵育1h形成dsdna t1w1和t2w2。

4.根据权利要求1所述的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，将携带mb标签的a1和携带fc标签的a2以终浓度为1μm滴加在金电极表面，在温度为4℃孵育8h。

5.根据权利要求1所述的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，aβo锚定链a1中携带mb标签，tau锚定链a2中携带fc标签，mb标签和fc标签通过切刻酶切割从金电极的表面移除，重新获得自由的双足dna步行者继续在电极表面上移动，产生循环扩增效应；因此，当加入aβo和tau时dna步行者w链被释放，在切刻酶的辅助下，在电极表面循环切割底物，产生放大的电化学信号。

6.根据权利要求1所述的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，将0.5μlnt.a1wi与0.5μl nb.bbvci与经磁分离的w链同时滴加在金电极37℃时反应，反应时间为1h。

7.权利要求1所述的制备方法制得的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器。

8.权利要求1所述的双切刻酶驱动的双自由足dna步行者生物传感器在检测阿尔兹海默病相关生物标志物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种双切刻酶驱动的双自由足DNA步行者生物传感器及其制备方法和应用，首先，通过功能性磁珠上的生物素化适体与AβO和Tau之间的竞争性结合作用来释放DNA双足。然后，游离的DNA两足在双切刻酶的辅助下在电极表面上行走，并从电极表面释放AβO和Tau的底物，产生一对多的信号放大效应。DNA步行者作为制备生物传感器的元件被用于检测疾病相关生物标志物已得到广泛的探索和应用。本发明的传感器不仅可以同时灵敏检测AβO和Tau，而且以相互补充的方式使AD的诊断更加精准。

技术研发人员：焦瑾,程涛
受保护的技术使用者：山东第一医科大学（山东省医学科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14