一种检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及化学发光免疫分析法，具体涉及一种检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，clia)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、小分子、抗体和药物等的分析技术。根据游离物和结合物是否需要分离，可分为均相和非均相测定。

2、共振能量转移效应通过免疫反应使一对与抗体偶联的dna间距离拉近，进而引发dna组装、触发级联dna组装并产生检测信号，可实现对目标检测物的灵敏检测。该方法可均相进行，简单、快速、灵敏。

3、专利《基于邻位触击效应和氧化石墨烯淬灭吖啶酯化学发光的均相免疫分析方法及使用设备》(cn111007239b)，在进行实际检测时灵敏度和稳定性还存在欠缺，无法保证检测值的准确性。

4、诊断测试的灵敏度是指正确识别患有疾病的患者的能力。高灵敏度有利于有效识别携带病原体的患者。因为极少量的分析物可能对界定疾病状态、疾病筛查或揭示是否存在有毒物质、污染物质、传染病原体等具有重要意义。测试越敏感，假阴性结果就越少，有助于预防感染以及早期实施治疗措施。灵敏度作为一项重要的技术指标，对试剂盒的评价具有重要意义。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供了一种在检测低浓度样本时的灵敏度高、稳定性好的均相免疫分析检测用试剂盒。

2、技术方案：本发明提供的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如下检测溶液：dna1-抗体1-过氧化物酶偶联物、dna2-抗体2偶联物、标记ae的dna3和go-aod复合物；其中，抗体1和抗体2为两种不同的肌钙蛋白i抗体；dna1与dna2有7个碱基互补，dna3分别有8个碱基和dna1、dna2互补配对。

3、进一步地，所述过氧化物酶包括乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶、钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶、木质素过氧化物酶中的一种或几种。

4、本发明提供的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如下检测溶液：dna1-抗体1-铁复合物偶联物、dna2-抗体2偶联物、标记ae的dna3和go-aod复合物；其中，抗体1和抗体2为两种不同的肌钙蛋白i抗体；dna1与dna2有7个碱基互补，dna3分别有8个碱基和dna1、dna2互补配对。

5、进一步地，所述铁复合物包括氯化血红素、mn-tpps4。

6、进一步地，所述dna1-抗体1-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体1-铁复合物偶联物是将dna1与抗体1-过氧化物酶偶联物/抗体1-铁复合物偶联物上的抗体1的氨基共价结合得到，所述抗体1-过氧化物酶偶联物/抗体1-铁复合物偶联物是通过抗体1上的氨基与过氧化物酶/铁复合物醛化后的羰基共价结合得到。

7、进一步地，所述dna2-抗体2偶联物是将dna2与抗体2上的氨基共价结合得到。

8、进一步地，所述dna1-抗体1-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体1-铁复合物偶联物中，dna1的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述dna2-抗体2偶联物中，dna2的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述dna3的核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、进一步地，所述dna1-抗体1-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体1-铁复合物偶联物的浓度为400～600ng/ml，dna2-抗体2偶联物的浓度为200～400ng/ml，标记吖啶酯ae的dna3的浓度为0.15μm，氧化石墨烯go结合抗氧化剂aod的浓度为20μg/ml。

10、进一步地，所述dna1、dna2、dna3的核苷酸序列中的g为isog，c为isoc。

11、本发明还提供了一种上述的检测试剂盒在检测肌钙蛋白i含量中的应用。

12、本发明还提供了一种基于氧化石墨烯-抗氧化剂淬灭共振能量转移的吖啶脂均相免疫分析检测方法，包括以下检测步骤：

13、1)将含有不同目标分子浓度的校准溶液与上述的检测试剂盒中的检测溶液混合，温育，加入化学发光底物，并检测该溶液的化学发光信号记录化学发光值，根据校准溶液的化学发光值绘制校准曲线，得到校准溶液与化学发光强度之间的标准曲线；

14、2)将待测样品与上述的检测试剂盒中的检测溶液混合，温育，加入化学发光底物，并检测待测样品的化学发光信号，得到待测样品的化学发光值；将待测样品的化学发光值带入校准曲线中即可获得待测样品中目标分子的浓度。

15、当没有目标蛋白存在时，dna3通过π-π堆积作用吸附在go表面，加入化学发光底物h2o2后，dna3末端标记的ae由于抗氧化剂在go上的存在无法氧化发光。在有目标蛋白存在时，两个抗体-dna复合物上的抗体实现双抗夹心，使dna1和dna2足够接近而形成邻位复合物，并能与dna3杂交。复合物几乎不会被go吸附，偶联在石墨烯上的aod也不影响复合物上的ae发光，且因为复合物中引入了邻位的过氧化物酶/铁复合物，加入化学发光底物h2o2后可以在复合物周围产生更多的单线态氧，增强了ae的发光强度。

16、进一步地，所述校准溶液的浓度范围为0.01～50ng/ml。

17、进一步地，所述dna3还包括5’端修饰nh2c6，通过b-氰乙基化学反应与引物5’糖环连接；再通过加入吖啶酯形成dna3-ae。

18、具体地，所述dna1含有55个碱基，dna2含有53个碱基，dna3含有22个碱基；dna3 5’端修饰nh2c6(5'aminolinker(c6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过b-氰乙基化学反应添加到引物5’糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。dna3从5’端开始的3-10与dna2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基完全互补；dna3从3’端开始的5-12与dna1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基完全互补。

19、进一步地，所述待测样品包括含有待测目标分子的全血//血清/血浆。

20、进一步地，所述温育条件为37℃下温育5-10分钟。

21、进一步地，所述化学发光底物为过氧化氢，100mm ph＝10。

22、本发明还提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如下检测溶液：dna1-抗体-过氧化物酶偶联物、dna2-支架小分子偶联物、标记ae的dna3和go-aod复合物；其中，抗体为甲状腺素抗体，支架小分子为甲状腺素抗原；dna1与dna2有7个碱基互补，所述dna3分别有8个碱基和dna1、dna2互补配对。

23、进一步地，所述过氧化物酶包括乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶、钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶、木质素过氧化物酶中的一种或几种。

24、本发明提供的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如下检测溶液：dna1-抗体-铁复合物偶联物、dna2-支架小分子偶联物、标记ae的dna3和go-aod复合物；其中，抗体为甲状腺素抗体，支架小分子为甲状腺素抗原；dna1与dna2有7个碱基互补，所述dna3分别有8个碱基和dna1、dna2互补配对。

25、进一步地，所述铁复合物包括氯化血红素、mn-tpps4。

26、进一步地，所述dna1-抗体-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体-铁复合物偶联物是将dna1与抗体-过氧化物酶偶联物/抗体-铁复合物偶联物上的抗体的氨基共价结合得到，所述抗体-过氧化物酶偶联物/抗体-铁复合物偶联物是通过抗体上的氨基与过氧化物酶/铁复合物醛化后的羰基共价结合得到。

27、进一步地，所述dna2-支架小分子偶联物是将dna2与支架小分子上的氨基共价结合得到。

28、进一步地，所述dna1-抗体-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体-铁复合物偶联物中，dna1的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述dna2-支架小分子偶联物中，dna2的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述dna3的核苷酸序列如seq id no.3所示。

29、进一步地，所述dna1-抗体-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体-铁复合物偶联物的浓度为400～600ng/ml，dna2-支架小分子偶联物的浓度为200～400ng/ml，标记吖啶酯ae的dna3的浓度为0.15μm，氧化石墨烯go结合抗氧化剂aod的浓度为20μg/ml。

30、进一步地，所述dna1、dna2、dna3的核苷酸序列中的g为isog，c为isoc。

31、本发明还提供了一种上述的检测试剂盒在检测血清游离甲状腺素含量中的应用。

32、本发明还提供了一种基于氧化石墨烯-抗氧化剂淬灭共振能量转移的吖啶脂均相免疫分析检测方法，包括以下检测步骤：

33、1)将含有不同目标分子浓度的校准溶液与上述的检测试剂盒中的检测溶液混合，温育，加入化学发光底物，并检测该溶液的化学发光信号记录化学发光值，根据校准溶液的化学发光值绘制校准曲线，得到校准溶液与化学发光强度之间的标准曲线；

34、2)将待测样品与上述的检测试剂盒中的检测溶液混合，温育，加入化学发光底物，并检测待测样品的化学发光信号，得到待测样品的化学发光值；将待测样品的化学发光值带入校准曲线中即可获得待测样品中目标分子的浓度。

35、当没有目标小分子存在时，dna1-抗体-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体-铁复合物偶联物与dna2-支架小分子偶联物结合，使dna1和dna2足够接近而形成邻位复合物，并能与dna3杂交。复合物不会被go吸附，偶联在石墨烯上的aod也几乎不影响复合物上的ae发光，且因为复合物中引入了邻位的过氧化物酶/铁复合物，加入底物液h2o2后可以在复合物周围产生更多的单线态氧，增强了ae的发光强度。在有目标小分子存在时，竞争结合dna1-抗体-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体-铁复合物偶联物，使得部分dna1-抗体-过氧化物酶偶联物/dna1-抗体-铁复合物偶联物与dna2支架-小分子偶联物不能结合，部分dna3通过π-π堆积作用吸附在go表面，发光被淬灭。

36、进一步地，所述校准溶液的浓度范围为0.5～100pmol/l。

37、进一步地，所述dna3还包括5’端修饰nh2c6，通过b-氰乙基化学反应与引物5’糖环连接；再通过加入吖啶酯形成dna3-ae。

38、具体地，所述dna1含有55个碱基，dna2含有53个碱基，dna3含有22个碱基；dna3 5’端修饰nh2c6(5'aminolinker(c6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过b-氰乙基化学反应添加到引物5’糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。dna3从5’端开始的3-10与dna2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基完全互补；dna3从3’端开始的5-12与dna1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基完全互补。

39、进一步地，所述待测样品包括含有待测目标分子的全血//血清/血浆。

40、进一步地，所述温育条件为37℃下温育5-10分钟。

41、进一步地，所述化学发光底物为过氧化氢，100mm ph＝10。

42、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明通过将邻位过氧化物酶或铁复合物引入吖啶脂均相免疫分析检测方法，显著提升了检测方法在检测低浓度样本时的灵敏度和稳定性。