一种基于巯基乙醇衍生化策略的萘醌类化合物的分析检测方法与流程

本发明属于药物分析，具体涉及一种基于巯基乙醇衍生化策略的萘醌类化合物的分析检测方法。

背景技术：

1、萘醌类化合物是一类广泛存在于自然界中的小分子化合物，这类化合物因其独特的结构和生物活性，在多种疾病如抗癌、抗炎、抗氧化和抗病毒的治疗过程中发挥着重要作用，具有广阔的应用前景。例如，维生素k3，又名甲萘醌，有促凝血功能，可以用于治疗包括新生儿出血、低凝血酶原血症等在内的维生素k缺乏所引起的出血性疾病；胡桃醌具有止血和抗菌活性，可用于治疗湿疹、牛皮和发癣；1,4萘醌主要用作合成农药杀菌剂和染料中间体；苯醌可用作皮革鞣制剂、照相显影剂及制造染料、医药及化妆品原料。近年来，迅速发展的液相色谱串联质谱技术(lc-ms/ms)为萘醌类化合物的定量分析提供了可能的解决方案。同传统的萘醌类化合物的定量方法如紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法-质谱法联用等相比，液相色谱串联质谱方法在准确度、精密度、选择性和灵敏度等各方面均显示出较大优势。目前，现有研究中还没有灵敏度高、选择性好的测定生物样品中萘醌类化合物的液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)方法的报道。因此，建立能够准确、灵敏的定量萘醌类化合物的分析方法成为亟待解决的问题。

2、萘醌类化合物难以被定量的主要原因为具有不饱和结构，分子组合中只有c、h、o，在质谱esi离子源中不容易电离，且在二级质谱中不易被打碎，产生稳定的碎片。另一方面，萘醌类化合物在有机溶剂中稳定，但是在生物样品中高度不稳定，能够与蛋白的半胱氨酸和谷胱甘肽结合，导致其浓度水平极低，无法完成定量分析。因此，直接用液质联用技术测定萘醌类化合物灵敏度低，不能满足生物样品中对其的定量需求。sreelatha,t等通过硫醇和酰胺结合合成取代1,4-萘醌，以氧化银为催化剂得到中间产物，操作步骤相对复杂，成本较高。除此之外，ryu,c.k等通过溴化反应生成中间产物将硫醇引入到醌类化合物中，但此方法需要添加钯催化剂才可以生成目标化合物。作为萘醌类化合物中具有代表性的药物之一，胡桃醌在定量分析方面存在灵敏度低、不稳定的问题。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中的技术问题，本发明的目的在于建立一种基于巯基乙醇衍生化策略的萘醌类化合物的分析检测方法，本发明以胡桃醌为代表化合物，利用基于1,4-迈克尔加成反应原理并通过柱前衍生化的方法将可离子化基团巯基乙醇引入难以离子化的胡桃醌结构中，从而提高质谱检测特异性和灵敏度的策略，并通过多重反应监测得到的特定反应离子对，对待测物进行定量分析，柱前衍生化的方法使醌类化合物在质谱中的响应值显著提高，质谱检测灵敏度显著提高，此方法适合于复杂样品中痕量醌类化合物的定量分析检测。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种基于巯基乙醇衍生化策略的萘醌类化合物的分析检测方法，主要包括如下步骤：

4、(1)将巯基乙醇与萘醌类化合物进行衍生化反应；

5、(2)通过液相色谱分离，获得衍生化后的萘醌类化合物；

6、(3)将衍生化后的萘醌类化合物在离子源转换成带电气相离子，经三重四极杆-串联质谱进行分析检测。

7、基于上述技术方案，进一步地，所述的萘醌类化合物包括胡桃醌。

8、基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)的所述的衍生化反应具体为：将萘醌类化合物、内标与巯基乙醇溶于反应溶液，调整反应溶液的ph至4-10，在25～80℃下反应0.5-8小时。

9、基于上述技术方案，进一步地，反应溶液为体积比1:10-10:1的水-乙腈溶液；内标为甲萘醌，内标与萘醌类化合物的浓度比为1:1；萘醌类化合物的浓度为1～100μg/ml，巯基乙醇的浓度为0.1～100mg/ml。

10、基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)的液相色谱分离条件为：色谱柱：watersacquity uplc beh c18柱，2.1mm×50mm i.d.,1.7μm粒径；流动相：a相：含体积分数0.1％甲酸的水，b相：乙腈；梯度洗脱；柱温：40℃；流速：0.4ml/min；进样量：10μl。

11、基于上述技术方案，进一步地，梯度洗脱程序如下：0.1min 80％ a，1.5min 80％a，3.0min10％ a，3.5min 10％ a，3.6min 80％ a，5.0min 80％ a。

12、基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)的具体过程为：将衍生化后的萘醌类化合物在离子源中转换成带电气相离子，进入质谱第一重质量分析器q1中，经过电场的筛选，具有特定质荷比的离子进入第二重质量分析器q2中，碰撞诱导裂解成一系列的碎片离子，碎片离子进入第三重质量分析器杆q3或离子阱中，在特定电场的作用下再一次选择出稳定的信号响应高的离子作为子离子进入检测器中检测，基于母离子和子离子形成的离子对建立多重反应监测的分析方法，对待测物进行定量分析检测。

13、基于上述技术方案，进一步地，碰撞能量为5～15ev。

14、基于上述技术方案，进一步地，所述的萘醌类化合物的母离子为m/z 174.15；二级碎片离子为m/z 88.9，116.8，117.4，144.8；与巯基乙醇衍生化后的萘醌类化合物的特异性母离子为m/z 251.0，碎片离子为m/z 190.9，121.0。

15、基于上述技术方案，进一步地，巯基乙醇衍生化后的萘醌类化合物的特异性离子对为m/z251.0/190.9；萘醌类化合物的离子对为m/z 174.15/144.8。

16、基于上述技术方案，进一步地，质谱条件为：q-trap 6500型串联质谱仪，配有esi离子化源和analyst数据处理软件；胡桃醌为负离子方式检测；巯基乙醇衍生化后的萘醌类化合物为正离子方式检测；离子喷射电压5000v；温度50℃；源内气体1：氮气压力40psi；气体2：氮气压力40psi；气帘气体：氮气压力35psi；mrm扫描模式，解簇电压：60v。

17、基于上述技术方案，进一步地，测定生物样品中胡桃醌以及与巯基乙醇衍生化后的胡桃醌前包括样品前处理和标准曲线制备步骤。

18、本发明首次提出了基于巯基乙醇衍生化策略的萘醌类化合物的定量分析检测方法，利用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的高分辨率及高质量准确度，建立多重反应监测(mrm)分析方法；通过柱前衍生化方法将可电离的官能团引入带有不饱和结构的萘醌类化合物上，使萘醌类化合物在质谱中的响应及检测灵敏度显著提升，实现对复杂样品中的醌类化合物的定量分析检测；质谱(ms)参数中对应的碰撞能量为13ev；待测物在离子源转换成气相离子进入质谱，在三重四级杆中一级质谱扫描特定质荷比的离子进入碰撞室，在碰撞室中准分子离子碰撞诱导裂解，形成子离子进入第三级质谱，三级级质谱扫描特定质荷比离子进入检测器，分析物经能量碰撞产生子离子，通过对子离子进行扫描分析，建立稳定、可靠的lc-ms/ms分析方法。综上，运用多重反应监测(mrm)分析方法完成胡桃醌及与巯基乙醇衍生化后的胡桃醌化合物的定量分析。选取的胡桃醌的母离子为m/z 174.15；二级碎片离子为m/z 88.9，116.8，117.4，144.8；与巯基乙醇衍生化后的胡桃醌-巯基乙醇衍生物的特异性母离子为m/z 251.0，碎片离子为m/z190.9，121.0。

19、本发明的有益效果在于：

20、1)本发明采用柱前衍生化的方法将可离子化基团引入到难以离子化的萘醌类化合物的结构中，采用巯基乙醇作为衍生化试剂与胡桃醌进行迈克尔加成，由于巯基乙醇在有机试剂中是稳定的，化学性质活泼；在室温条件下，巯基容易和不饱和双键发生加和反应，反应效率高；与巯基乙醇衍生化反应后的产物由于含有硫原子，在质谱中更容易带电，能提高质谱检测灵敏度，解决了由于胡桃醌的不饱和化学结构中没有可电离的官能团导致待测分析物响应很低的问题，使响应值提高了750倍，在较大程度上提高检测灵敏度。

21、2)本发明首次提出了基于巯基乙醇衍生化策略的萘醌类化合物的定量分析检测方法，利用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的高分辨率及高质量准确度，建立多重反应监测(mrm)分析方法，该方法重现性好，准确度高，柱前衍生化法可以显著提高质谱检测响应及灵敏度，适合复杂生物样品中痕量醌类化合物的定量分析检测。