一种能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法和应用与流程

本发明属于细菌分型，具体涉及一种能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法和应用。

背景技术：

1、大肠埃希氏菌(escherichia coli，e.coli)属于革兰氏阴性菌，是一种条件致病菌，在正常情况下不致病，然而一些特殊血清型菌株可导致人或动物腹泻、腹痛甚至血性粪便，重症病例可能会并发溶血性的尿毒综合征以及血小板减少性紫癜，严重威胁着人类健康。更重要的是，大肠埃希氏菌能通过消化道进行传播感染，且在生产、包装及运输食品过程中极易传播，进而引发大量人群感染。因此，建立简便高效的追溯技术和分型方法、准确及时进行微生物溯源进而迅速锁定大肠埃希氏菌的污染来源是有效缩小感染影响范围，避免对人类健康和经济贸易产生重大损失的关键。

2、现有的对大肠埃希氏菌进行鞭毛分型(h抗原)的方法包括传统的血清学分型方法以及将大量鞭毛蛋白富集酶解后再进行lc/ms/ms分型两种方法。传统的血清学分型方法需要准备多达53种的标准血清型(即需要生产对应的特异性抗体)来对待检菌株进行凝集分型，其中，h11和h21血清型非常相似，不易使用血清学进行准确分型；此外，血清学分型凝集实验还会耗费过多的人力和时间。将大量鞭毛蛋白富集酶解后再进行lc/ms/ms分型能够避开传统血清学分型方法的各种弊端，但是整个过程因有富集鞭毛、膜上酶解消化等步骤而使得这一方法在实际应用中仍旧稍显繁琐。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明提供一种能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法和应用，该方法避免了传统血清学分型的各种弊端且无需大量富集鞭毛和膜上酶解消化，大幅缩短了检测时间。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法，包括以下步骤：

4、步骤a、将待测菌株在培养基上培养，从培养物中挑取单克隆菌落，置于双蒸水中并充分分散，加入胰酶溶液，在35～39℃消化至少1h；所述胰酶溶液中含有80～120μg/ml胰酶和80～120mmol/l碳酸氢铵，所述胰酶溶液与所述双蒸水的体积比为0.8～1.2:1；

5、步骤b、将步骤a所得消化液置于已被0.08～0.12％v/v甲酸水溶液润湿处理过的过滤器上，以10000～15000×g离心5～10min，收集滤液；

6、步骤c、向步骤b所得滤液中加入2～2.5倍量0.08～0.12％v/v甲酸水溶液，混匀后进行检测，根据检测结果判断待测菌株的类型和鞭毛分型。

7、本发明提供的上述方法不存在传统血清学分型方法的各种弊端，且无需进行大量富集鞭毛以及在膜上酶解消化等操作，大幅缩短了检测时间。检测结果不仅能够用于在种的水平鉴定待测菌株，还能准确鉴定其鞭毛分型。

8、结合第一方面，步骤a中所述培养基为羊血胰蛋白酶大豆琼脂培养基。

9、结合第一方面，步骤a中所述胰酶溶液中所述碳酸氢铵的浓度优选为100mmol/l。

10、结合第一方面，步骤a中所述胰酶溶液中所述胰酶的浓度优选为100μg/ml。

11、结合第一方面，步骤a中所述消化的温度优选为37℃。

12、结合第一方面，步骤a中所述胰酶溶液与所述双蒸水的体积比优选采用1:1。

13、结合第一方面，步骤b中所述甲酸水溶液的浓度优选为0.1％v/v。

14、结合第一方面，步骤b中优选以10000×g离心10min。

15、结合第一方面，步骤c中所述甲酸水溶液的体积为所述滤液体积的2倍。

16、结合第一方面，步骤c中所述甲酸水溶液的浓度优选为0.1％v/v。

17、结合第一方面，步骤c中所述检测的方法为液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)。

18、优选地，所述液相色谱-串联质谱法的色谱条件包括：

19、色谱柱：c18色谱柱；

20、流动相：流动相a为含有5％乙腈的0.1％v/v甲酸水溶液，流动相b为乙腈；

21、进行梯度洗脱，洗脱程序为：0→55min，流动相b的体积由5％线性增加到35％；

22、流速为300nl/min；

23、柱温为25～40℃。

24、优选地，所述c18色谱柱为0.075×15mm c18纳米柱。

25、优选地，所述液相色谱-串联质谱法的质谱条件包括：

26、以数据依赖模式采集质谱数据：每个扫描周期为一次剖面离子扫描和5次产物离子扫描。

27、第二方面，本发明提供了上述方法在鉴定细菌种属中的应用。

28、第三方面，本发明提供了上述方法在大肠埃希氏菌鞭毛分型中的应用。

技术特征：

1.一种能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述培养基为羊血胰蛋白酶大豆琼脂培养基；和/或

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述甲酸水溶液的浓度为0.1％v/v；和/或

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述甲酸水溶液的体积为所述滤液体积的2倍；和/或

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤c中所述检测的方法为液相色谱-串联质谱法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱法的色谱条件包括：

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱法的质谱条件包括：以数据依赖模式采集质谱数据：每个扫描周期为一次剖面离子扫描和5次产物离子扫描。

8.权利要求1～7任一项所述的能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法在鉴定细菌种属中的应用。

9.权利要求1～7任一项所述的能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法在大肠埃希氏菌鞭毛分型中的应用。

技术总结
本发明属于细菌分型技术领域，具体涉及一种能同时对大肠埃希氏菌进行鉴定和鞭毛分型的方法和应用。该方法首先将待测菌株的单克隆菌落在水中分散，以含有胰酶的碳酸氢铵溶液消化后，用浸润过甲酸的过滤器进行过滤，向滤液中加入甲酸后，即可进行检测。该方法不存在传统血清学分型方法的各种弊端，且无需进行大量富集鞭毛以及在膜上酶解消化等操作，大幅缩短了检测时间。检测结果不仅能够用于在种的水平鉴定待测菌株，还能准确鉴定其鞭毛分型。

技术研发人员：张丽杰,赵振军,左惠芬,冯忠军,黄印启,郑翠影,郝佳豪,叶佳情,宋明慧,金素丽,赵培,张亚光
受保护的技术使用者：张丽杰
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16