一种用于检测猪囊尾蚴的时间分辨荧光免疫试纸条及其制备方法

本发明属于免疫学检测，特别涉及一种用于检测猪囊尾蚴的时间分辨荧光免疫试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、猪囊尾蚴是猪带绦虫的中绦期幼虫，其导致的囊虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病。猪囊尾蚴病严重危害人或家畜(猪等)的健康，甚至导致残疾或死亡，其中以神经系统囊虫病(neurocysticercosis，ncc)最为严重。猪带绦虫病仍存在于整个美洲、撒哈拉以南非洲，并且在印度尼西亚的巴厘岛和巴布亚仍然十分流行。在中国2022年6月最新人兽共患传染病名录中仍将囊尾蚴病作为重点关注的一种人兽共患传染病。调查表明，猪囊虫病抗体检测阳性率为3％～75％，抗原检测阳性率为5％～55％，直接对屠宰动物进行检测，囊虫阳性率为0.1％～29％。

2、为了减少猪囊尾蚴病在全球带来的影响，亟需一种准确性高、特异性强、灵敏度好的快速检测方式，特别是在一些发展中国家缺乏医疗条件的偏远地区。在屠宰检疫中的必检项目如旋毛虫和囊尾蚴等的检测如果仅仅是依靠肉眼观察来诊断，极易造成漏检，严重影响肉品质量，同时也给消费者的健康构成巨大威胁。所以在囊尾蚴病流行地区常用血清学测试来检测动物是否感染寄生虫，常用方法有dot-abc-elisa法，间接elisa法等。虽然目前已经公布了许多猪囊尾蚴病的血清学试验方法，并声称这些方法能灵敏和特异的检测猪囊尾蚴病，特别是安特卫普热带医学研究所开发的apdia循环抗原试验，以及美国疾控中心开发的使用小扁豆凝集素纯化囊虫糖蛋白的酶联免疫电转移印迹(eitb)。但尽管最初声称这些试验在特异性和敏感性方面都接近完美，但随后证明这两种试验对猪囊尾蚴病的诊断实际上是无用的，因为特异性差——大多数血清学阳性动物根本没有猪囊尾蚴感染。并且显而易见，这些方法需要昂贵的仪器设备、专业的操作人员、复杂的数据处理及灵敏性不理想等问题，它们均不适合现场大范围快速的检测。因此，亟需提供一种低背景、高特异性、高灵敏度、线性范围宽、高稳定性、多标记检测的检测方法，以应对猪囊尾蚴的大范围、快速现场检测。

技术实现思路

1、本发明提出一种用于检测猪囊尾蚴的时间分辨荧光免疫试纸条及其制备方法，使用时间分辨荧光微球作为标记物，通过对一系列固相材料的筛选及反应体系和反应条件的不断优化，研制了一种使用六钩蚴时期的原核表达重组蛋白tsol18作为抗原的猪囊尾蚴荧光免疫层析试纸条，以解决现有技术中的上述技术问题。

2、主要技术方案包括：一种用于检测猪囊尾蚴的时间分辨荧光免疫试纸条，所述试纸条顺次包括衔接于底板上的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样本垫设有加样孔；所述样本垫的材质为玻璃纤维素膜；所述结合垫上包被有荧光探针；所述荧光探针包括作为捕获探针的时间分辨荧光微球耦联的六钩蚴期重组蛋白tsol18抗原和作为指示探针的时间分辨荧光微球耦联的山羊抗兔igg；所述硝酸纤维素膜上包被有质控线和检测线；所述质控线上包被有小鼠抗猪igg；所述检测线上包被有兔抗山羊igg。

3、进一步地，所述玻璃纤维素膜为sb08；所述时间分辨荧光微球为eu纳米颗粒；所述结合垫材质为sb06；所述硝酸纤维素膜材质为硝酸纤维素膜cn140；所述吸水垫材料为sx42。

4、进一步地，所述质控线上包被的兔抗山羊igg包被量为1mg/ml；所述检测线上包被的小鼠抗猪igg包被量为2mg/ml。

5、进一步地，所述时间分辨荧光微球耦联tsol18抗原荧光探针和时间分辨荧光微球耦联山羊抗兔igg荧光探针按照4:1的比例包被于结合垫。

6、进一步地，所述试纸条还包括样品稀释液，所述样品稀释液成分为0.01mpbs、1％bsa、10％蔗糖、0.2％tween 20，ph7.2。

7、用于检测猪囊尾蚴的时间分辨荧光免疫试纸条的制备方法，包括如下步骤：

8、s1、猪囊尾蚴活性tsol18抗原的制备；

9、s2、时间分辨荧光微球与山羊抗兔igg和猪囊尾蚴tsol18抗原的耦联；

10、s3、结合垫的制备：将与时间分辨荧光微球耦联的山羊抗兔igg和猪囊尾蚴tsol18抗原包被在结合垫上，真空抽干后干燥备用保存；

11、s4、质控线和检测线的制备：将兔抗山羊igg和小鼠抗猪igg按照1：2的质量比，分别包被在硝酸纤维素膜上，形成质控线与检测线，室温干燥2-3小时，密封保存备用；

12、s5、组装试纸条：在底板上按照加入样品后液体层析方向依次将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫粘贴在底板上，试纸条制备完成。

13、进一步地，所述s1中：

14、所述提取囊尾蚴虫体总rna，取囊尾蚴时期虫体总rna混合后进行反转录，得到cdna模板；采用如seq id no:1、seq id no:2所示的引物进行扩增，获得如seq id no:3所示的核苷酸序列；回收后与载体连接、转化、培养、抽提，获得重组质粒，并进行酶切鉴定；扩大培养，纯化，得到所述猪囊尾蚴活性蛋白tsol18。

15、进一步地，所述s2中：

16、所述时间分辨荧光微球与山羊抗兔igg的耦联的方法如下:100μg 1％(w/v)的时间分辨荧光微球经过14000g离心去除保存液中的磷酸盐和甘油，加入ph为6.2的0.05mol/l2-吗啉乙磺酸mes溶液100μl重悬混匀，再次14000g离心去上清；加入ph为6.2的0.05mol/l2-吗啉乙磺酸mes溶液100μl，浓度为10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺edc1μl，浓度为15mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺nhs1.5μl，混匀孵育0.5h；反应结束后离心去上清，加入ph为7.2浓度为0.025mol/l的磷酸盐缓冲液重悬，混匀后超声6min；然后加入5μg山羊抗兔igg，室温孵育2h；反应结束后离心去上清，加入200μl封闭液室温封闭2h，所述封闭液为0.1mol甘氨酸加1％bsa的水溶液；封闭完成后离心去上清，加入200μl保存液重悬混匀，所述保存液为含25mmol/l的tris-base，0.05％的tween-20，0.15mol/l的nacl，0.05％的proclin 300，1％的bsa和5％的海藻糖的ph为7.2的溶液，超声6min后4℃冷藏保存。

17、进一步地，所述s3中：

18、所述包被荧光探针的速度为10μl/cm。

19、进一步地，所述s4中：

20、所述喷涂质控线与检测线的速度为1μl/cm。

21、与现有技术相比，本发明提供了一种用于检测猪囊尾蚴的时间分辨荧光免疫试纸条及其制备方法，本发明通过对一系列固相材料的筛选及反应体系和反应条件的不断优化，研制了一种使用六钩蚴时期的原核表达重组蛋白tsol18作为诊断抗原的猪囊尾蚴病荧光免疫层析试纸条。

22、本发明所述方法，具备以下有益效果：

23、(1)本发明利用六钩蚴时期的原核表达重组蛋白tsol18作为猪囊虫病的抗体检测抗原，所发明的荧光免疫层析试纸条与elisa相比具有高的灵敏性和特异性；

24、(2)本发明显著缩短了检测时间以及结果更易判定，不与其他寄生虫阳性血清发生反应，保存时间长，效果稳定；

25、(3)本发明所述时间分辨荧光微球免疫层析法是一种将时间分辨荧光技术应用于免疫分析的新型检测方法，该方法采用时间分辨荧光微球作为标记物，每个时间分辨荧光微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高标记效率，有效地提高其灵敏度；同时时间分辨荧光微球表面修饰有合适密度的羧基，用于与蛋白或抗体的共价耦联，提高标记物的稳定性，时间分辨荧光微球在检测中具有很高的应用潜力；时间分辨荧光微球免疫诊断技术具有低背景、高特异性、高灵敏度、线性范围宽、高稳定性、多标记检测等一系列的检验先进性。

26、(4)本发明可用于大批量检测，极具市场前景。