盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法与流程

本发明属于医药，涉及药品的质量分析方法，特别是涉及一种盐酸米诺环素及其杂质，更特别地是涉及一种使用高效液相色谱来检测盐酸米诺环素中的有关物质的方法，本发明的有关物质检测方法可以同时检测到十种以上的盐酸米诺环素中的有关物质。

背景技术：

1、米诺环素(minocycline，二甲胺四环素)，临床上常用其盐酸盐。盐酸米诺环素的分子式为c23h27n3o7·hcl，分子量为493.94，化学名为：[4s-(4α,4aα,5aα,12aα)]-4,7-双(二甲氨基)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-2-并四苯甲酰胺盐酸盐，其化学结构式如下：

2、

3、盐酸米诺环素为黄色结晶性粉末，无臭，有引湿性；在甲醇中溶解，在水中略溶，在乙醇中微溶，在乙醚中几乎不溶。

4、米诺环素属于第二代四环素类抗生素，是一种长效高效的半合成四环素类抗生素，其抗菌谱与四环素相似，抗菌作用为四环素类中最强，抗革兰阳性菌活性比四环素强2～4倍，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有很强的活性，四环素类抗生素之间存在交叉耐药，但米诺环素对临床分离的耐四环素金葡萄、表葡菌和链球菌均有很强的抗菌活性，因其对耐药菌有效而在临床上受到青睐。不良反应与其他四环素类基本相同，可引起可逆性前庭反应，包括恶心、呕吐及运动失调等。

5、以盐酸米诺环素原料药为例，米诺环素原料药收载于中国药典2020年版本、美国药典usp(生效日期为2020年5月1日)、欧洲药典(ep11.0)和日本药典(jp18)。

6、中国药典2020年版中采用乙酸铵-二甲基甲酰胺-四氢呋喃-乙二胺四乙酸二钠的流动相体系和c8色谱体系，对有关物质进行控制，主要控制的杂质有差向米诺环素(<1.2％)、其他单一杂质(<1.2％)和其他杂质总量(<2.0％)。而在usp、ep和jp的现行药典中，盐酸米诺环素原料药有关物质检测方法流动相体系均为：草酸盐-二甲基甲酰胺-四氢呋喃-乙二胺四乙酸二钠体系，对差向异构体、其他单一杂质和杂质总量进行控制。

7、然而，一方面，面对日趋严格的有关物质杂质控制要求，大多数企业内部对于特定杂质的控制不仅限于差向异构体，往往需要对几种甚至十几种特定杂质进行分离和检测，以便更好地控制产品的品质。然而，采用现行标准中的分析方法，差向米诺环素峰、其他杂质，与米诺环素峰，以及部分杂质峰间不能有效分离。因此，需要开发专属性和选择性更好的分析检测方法，对复杂的特定杂质和未知杂质均能有效分离。

8、随着社会的发展和对人体健康安全的重视程度加深，在实验过程中，运用绿色分析化学理念，减少一些有毒有害试剂的使用已经成了必然趋势。目前，在四环素类抗生素的有关物质检测过程中，主流的检测方法仍然会在配制流动相时，使用四氢呋喃、二甲基甲酰胺等有毒有害试剂，对实验人员身体造成慢性损害，废液的排放也会加重环境污染。为了保障分析人员健康，减少环境污染问题，应尽量避免上述试剂的使用，或者无法避免使用有机试剂时，用低毒性的替代试剂。

9、目前，有相关的研究团队在进行低毒性溶剂替代方面进行探索研究，也取得了一定进展。例如，高燕霞团队的文献[高燕霞,姜建国,杜增辉.hplc法测定注射用盐酸米诺环素的含量及有关物质[j].中国抗生素杂志，2005，30(12)：744-746]报道，使用kromasil c8(4.6mm×250mm，5μm)柱，以0.2mol/l乙酸铵∶n,n-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃(600∶398∶2，内含0.01mol/l乙二胺四乙酸二钠)为流动相，检测波长280nm，对盐酸米诺环素有关物质进行检测时，能够对5个特杂：去甲基金霉素、6-去甲四环素(dmtc)、6-去甲-6-去氧四环素(dmdotc)、11a-氯-6-去甲-6-去氧四环素(11a-c-l dmdotc)、7-氨基-6-去甲-6-去氧四环素(admdotc)进行有效分离和控制。该方法采用水溶性更好的乙酸盐，降低了盐浓度，避免使用草酸盐(其在低温环境下结晶析出，进而容易损坏仪器和色谱柱)，具有更好的适用性，但是，此文献方法仅对5个特定杂质进行控制，无法满足有关物质中对多个复杂特定杂质的控制要求。

10、王珑团队的文献[王珑，王红梅.高效液相色谱法测定盐酸米诺环素的有关物质[j].海峡药学，2006年，18(12006):85-86]，采用kromasil c8色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以醋酸铵缓冲液-乙腈-甲醇(830:170:5)用浓氨水或醋酸调节至ph6.55为流动相，检测波长为280nm，对盐酸米诺环素中可能存在的8种杂质：①7-双去甲基米诺环素，②去甲基四环素，③地美环素，④7-单去甲基米诺环素，⑤吡唑米诺环素，⑥去甲基脱氧四环素，⑦4-差向-米诺环素，⑧羟甲基米诺环素，进行分离和测定，满足上述8种杂质控制的检测要求，又用甲醇、乙腈来替代四氢呋喃作为有机相，降低四氢呋喃对人体的伤害。

11、梅芊团队的文献[梅芊,李同辉,李少杰,等.盐酸米诺环素胶囊的质量评价[j].中国抗生素杂志，2020，45(3)：224-233]，采用色谱柱为dikma platisil ods(250mm×4.6mm，5μm)；流动相a为0.05mol/l醋酸铵溶液(用氨水调节ph值至8.0)，流动相b为甲醇，流动相c为乙腈，进行梯度洗脱程序，流速1.0ml/min；紫外检测器，检测波长280nm；柱温30℃；进样量10μl，对米诺环素中有关物质进行检测。该方法较现行药典方法柱压更低、杂质间分离效果更好、多检出3种杂质、系统更稳定，除检出差向米诺环素杂质之外，另外检出未知杂质10种，均有效分离。

12、但是，随着分离技术的不断提高，更多的特定杂质分离提纯出来，企业对杂质控制的要求也日趋严格，特杂的种类增加，增加至十几种、二十几种，限度收紧等方面影响，依靠现有检测手段很难将杂质完全分离，还需要继续改进优化来发展新的分析方法，提高有关物质检测中杂质的分离和检测能力。目前，国内大多数用于盐酸米诺环素原料药检测的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱(c18)或辛烷基硅烷键合硅胶(c8)色谱柱，容易产生峰展宽，拖尾等现象。

13、然而，本领域仍然需要有新的检测盐酸米诺环素中的有关物质的方法，例如期待该方法能够提高柱效、改善杂质之间分离效果、色谱柱具有更高的通量和更高的柱效等一种或多种有益效果，为抗生素有关物质方法的开发提供一种新的有益选择。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法，期待该种方法能够呈现一个或多个方面的有益效果，例如测定方法准确可靠、劳动保护的成本低等等。

2、为此，要发明第一方面提供了测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法，包括如下操作：

3、(1)照高效液相色谱法的规范进行，各测试溶液临用新制；

4、(2)测试溶液的制备：

5、供试品溶液：取供试品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含米诺环素1mg的溶液；

6、对照品溶液：取盐酸米诺环素对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液；

7、系统适用性溶液：取盐酸米诺环素系统适用性对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液；

8、灵敏度溶液：精密量取对照品溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液；

9、(3)色谱条件：

10、用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以含有0.002mol/l乙二胺四乙酸二钠的0.25mol/l乙酸铵溶液-甲醇(90:10)混合液(用氨水或冰醋酸调节ph值至6.75±0.05)作为流动相a，以乙腈-甲醇(90:10)为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为280nm；样品盘控温2～8℃，进样体积10μl；

11、 时间(分钟) 流动相a(％) 流动相b(％) 0 95 5 12 92 8 22 92 8 42 85 15 50 75 25 60 75 25 60.1 95 5 70 95 5

12、系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，米诺环素峰与rs12峰的分离度应不小于1.5；灵敏度溶液色谱图中，主峰信噪比应不小于10；对照品溶液连续进样6次，米诺环素峰面积的相对标准偏差应不大于5.0％；

13、(4)测定并计算杂质百分量：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有下表所列相对保留时间(rrt)对应的杂质峰，按加校正因子的主成分对照品外标法计算该杂质的百分量，

14、

15、

16、根据本发明第一方面所述的方法，其中所述高效液相色谱法的规范是历届版本的中国药典或者美国药典或者欧洲药典或者日本药典中收载的高效液相色谱法的规范，例如是中国药典2020年版四部通则0512高效液相色谱法的规范。

17、根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质rs02、rs16、rs32、rs03、rs12、rs15、rs11和米诺环素。

18、根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质rs02、rs16、rs32、rs03、rs12、rs15、rs11和米诺环素，还包含杂质rs17、杂质rs28、杂质rs30、杂质rs33、杂质rs40，其结构式和/或化学名分别为：

19、杂质rs17：

20、(4s,4as,5ar,12as)-9-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(9-氨基山环素)，

21、杂质rs28或称9-氨基米诺环素：

22、

23、杂质rs30或称单甲基乙基米诺环素：

24、

25、杂质rs33：

26、(4s,4as,5ar,12as)-7-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(7-氨基山环素)，

27、

28、杂质rs40或称去甲金霉素：

29、

30、根据本发明第一方面所述的方法，其中十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱是agilent infinitylab poroshell hph-c18柱，其规格为4.6mm×150mm，2.7μm，或者是效能相当的其它色谱柱。

31、根据本发明第一方面所述的方法，其中检测到盐酸米诺环素中含有符合如下限度规定的杂质时认为该盐酸米诺环素合格：rs03不得过1.2％，rs32不得过0.8％，rs02不得过0.6％，rs11不得过0.6％，rs12不得过0.5％，rs15不得过0.5％，rs16不得过0.3％，其他单个杂质不得过0.10％，杂质总量(除rs03外)不得过2.0％，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)忽略不计。

32、根据本发明第一方面所述的方法，其中米诺环素峰的理论板数大于1万例如大于2万例如大于5万。

33、根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质rs02、rs16、rs32、rs03、rs12、rs15、rs11和米诺环素，各相邻峰之间的分离度均大于1.5。

34、根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质rs02、rs16、rs32、rs03、rs12、rs15、rs11和米诺环素，还包含杂质rs17、杂质rs28、杂质rs30、杂质rs33、杂质rs40，各相邻峰之间的分离度均大于1.5。

35、根据本发明第一方面所述的方法，其中检测到盐酸米诺环素中含有符合如下限度规定的杂质时认为该盐酸米诺环素合格：杂质rs17不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质rs28不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质rs30不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质rs33不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质rs40不得过0.2％例如不得过0.10％。

36、根据本发明第一方面所述的方法，其中供试品溶液色谱图中，米诺环素与相邻杂质之间的分离度大于2.0

37、进一步的，本发明第二方面提供了一种盐酸米诺环素，其使用本发明第一方面任一实施方案所述方法测定其中的有关物质，该盐酸米诺环素中检出具有如下限度规定的杂质：不超过1.2％的rs03，不超过0.8％的rs32，不超过0.6％的rs02，不超过0.6％的rs11，不超过0.5％的rs12，不超过0.5％的rs15，不超过0.3％的rs16，不超过0.10％的其他单个杂质，不超过2.0％的杂质总量(除rs03外)，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)忽略不计。

38、根据本发明第二方面的盐酸米诺环素，其使用本发明第一方面任一实施方案所述方法测定其中的有关物质，该盐酸米诺环素中检出具有如下限度规定的杂质：不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质rs17，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质rs28，不超过0.2％例如不超过0.1％的杂质rs30，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质rs33，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质rs40。

39、本发明方法取得了一些优良效果。例如，本发明方法分离的杂质数量多，可以对12种特定杂质进行有效分离和检测，各杂质之间、杂质与主峰之间的分离度均大于1.5；克服了杂质之间分离度不佳、回收率低、溶液稳定性差的问题；本发明选用特定的液相色谱柱，提高未知杂质之间的分离度，克服了个别未知单杂分离较差导致合并积分，单一杂质限度收紧困难的问题，单一杂质限度可由0.15％收紧至0.10％；本发明方法的流动相中不含有n,n-二甲基甲酰胺及四氢呋喃等毒性较大物质，绿色环保，减少对人体损害，并且提高仪器和色谱系统的稳定性，安全性高，操作简便，成本低。