抗淬灭剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及免疫生物学，具体地，涉及一种抗淬灭剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、荧光染料是免疫组化和细胞染色常用的试剂之一，其主要目的是通过荧光的位置来定位某个蛋白质在细胞亚显微结构中的分布，或者通过荧光的强弱来判断蛋白在细胞中表达的丰度。生物学实验中使用的荧光染料可以分为alexa fluor系列染料，传统荧光染料如fitc和德州红(texas red)，以及荧光蛋白如gfp系列、多色gfp变体、dsred系列、mcherry等。

2、在细胞荧光染色(又叫免疫细胞化学，immunocytochemistry)和组织荧光染色(又叫免疫组织化学，immunohistochemistry)中，荧光染料通常会被标记在二抗上来检测某个特定蛋白在细胞或组织内的表达。

3、首先，细胞或组织会在含福尔马林的固定液里固定，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤后用阻断液(如含5％的山羊血清的pbs)阻断细胞或组织和抗体的非特异性结合。接下来细胞或组织会和含有抗目标蛋白的一抗(一般稀释在阻断缓冲液里，稀释比例为1:1000，具体浓度根据抗体本身的敏感性和原始浓度决定)在室温下孵育1-2h，或者在4℃孵育过夜。孵育结束后，细胞或组织会在pbs或类似的缓冲液里洗3次，每次5min。清洗后的细胞或组织会在含有荧光染料标记的二抗(一般稀释在阻断缓冲液或pbs里，按1:500-1000稀释)里室温孵育1h。孵育结束后，细胞或组织会在pbs或类似的缓冲液里洗3次，每次5min。最后，在使用荧光显微镜或共聚焦显微镜拍照之前，要在细胞或组织切片上加上抗淬灭剂，以防荧光染料褪色。对于表达丰度高的蛋白，荧光染料可以直接标记在一抗上。反过来，对于表达丰度极低的蛋白质，二抗上通常会标记生物素，生物素会和标记荧光染料的streptavidin结合并以此放大信号。

4、长期以来，荧光染料的漂白，也就是染色后细胞或组织切片上荧光的衰减一直是困扰细胞或组织的荧光染色的问题。荧光染料的漂白原因主要有两种：第一，染料本身的属性。荧光衰减是一个不可避免的过程，荧光染料之间的衰减速度也差别很大。目前市场上常见的alexa fluor系列染料如488、555、594和647等和传统的染料比起来不仅亮度增加，而且衰减速度明显变慢。第二，在显微照相时显微镜的激发光尤其是共聚焦显微镜的激光会加速荧光染料的漂白速度。这一点对于表达丰度很低的蛋白非常明显，因为蛋白表达量低导致荧光信号很弱，在用共聚焦显微镜照相时往往需要加大激光能量输出的强度而导致荧光信号迅速衰减。因为荧光的减弱或淬灭不仅严重影响图片的质量(最佳分辨率低)和实验结果的可靠性，所以在细胞或组织染色完成时，往往在封片前加入抗衰减剂对荧光进行保护。

5、市场上常用的保护荧光信号的抗淬灭剂以甘油(glycerol)或tris-hcl缓冲液为母液，加入抗荧光衰减的化学成分如1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane，简称dabco)。对苯二胺(p-phenylenediamine，简称ppd)是另外一种抗荧光衰减的化学物。如果需要对细胞核中的dna进行复染，抗淬灭剂中还可以加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，简称dapi)。市场上常用的抗淬灭剂有如下一些缺点：1)只对某些荧光染料有效，不能做到全覆盖。比如，ppd只对fitc、texas red、amca、alexa fluor 488、alexa fluor 594、和四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，tritc)有保护作用，而对其他的荧光染料的保护效果不是很理想。2)市场上现有的大部分抗淬灭剂都不能解决强激发光或拍摄时间过长造成的荧光信号衰减的问题。而当靶向蛋白的丰度过低时，这个问题尤其突出。

6、因此，亟需研究出一种可以适用于更多的荧光染料，减缓荧光染料的衰减的抗淬灭剂。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决目前市场上常用的抗淬灭剂只对某些荧光染料有保护作用，不能做到全覆盖，同时，存在因强激发光或拍摄时间过长造成的荧光信号衰减的问题，从而提供一种抗淬灭剂及其制备方法和应用，该抗淬灭剂具有抑制广谱荧光染料的光漂白、应用广泛、保存时间久，经济实惠等优点，同时，该抗淬灭剂制备方法简单快捷，不仅如此，该抗淬灭剂采用独特配方，有效地解决了细胞或组织样品中荧光染料的光稳定性问题，大大提高了捕获的荧光信号的敏感度，从而可以实现对荧光信号进行更准确的定量。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种抗淬灭剂，该抗淬灭剂包括包括组方a和组方b；

3、其中，所述组方a中含有酸碱缓冲液、电解质和保湿增稠剂；

4、所述组方b中含有抗荧光淬灭复合物和溶剂；

5、所述抗荧光淬灭复合物含有没食子酸丙酯、二氨基环己烷和p-苯二胺。本发明第二方面提供了一种抗淬灭剂的制备方法，该制备方法包括：

6、1)先将电解质与酸碱缓冲液混合得到混合溶液，灭菌，再在混合溶液中加入保湿增稠剂进行混合制备得到组方a；

7、2)将抗淬灭复合物和溶剂进行混合制备得到组方b。

8、本发明第三方面提供了一种上述制备方法制备的抗淬灭剂。

9、本发明第四方面提供了一种上述的抗淬灭剂在保护细胞或组织荧光信号稳定性中的应用。

10、本发明第五方面提供了一种保护细胞荧光信号稳定性的方法，所述方法包括：

11、1)细胞用目标一抗孵育结合后，再对细胞用荧光二抗进行荧光染色标记；

12、2)将抗淬灭剂滴到包含细胞的盖玻片、载玻片或腔室载玻片上；

13、3)用快干指甲油滴在盖玻片一侧均匀涂抹以密封盖玻片所有侧面，立即拍摄图像或将载玻片保存；

14、其中，所述抗淬灭剂为上述的抗淬灭剂。

15、在上述技术方案中，本发明的抗淬灭剂(fadestoptmmounting medium，简称fadestoptm)采用独特的复合配方，可以强劲地稳定细胞或组织样品中荧光表征，并大大提高捕获荧光信号的敏感度，维持荧光染色样品时间保存久，有效地解决了细胞或组织样品中荧光染料的光稳定性问题，大大提高了捕获的荧光信号的敏感度，从而为实现荧光信号更准确的定量提供了保障。并且本发明的抗淬灭剂可以有效地阻滞广谱荧光染料的光漂白，这些染料包括，但不限于：alexa 405、dylight 405、dylight 350、alexa 350、hoechst33342、hoechst 33258、dapi、青色荧光蛋白(cfp),增强型青色荧光蛋白(ecfp)、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、gfp(s65t)、mitotracker green、fitc、dylight 488、alexa488、增强型黄色荧光蛋白(eyfp)、alexa 430、alexa 532、cy 3、alexa 555、dylight 549、alexa 546、tritc、mitotracker orange、dtomato、dsred、lysotracker red、cy 3.5、jc-1、mitotracker red、alexa 568、mcherry、texas red、dylight 594、alexa 594、dylight633、to-pro-3-dna、cy 5、dylight 649、alexa 647、alexa 660、cy 5.5、alexa680、dylight680、alexa 700。

16、同时，本发明抗荧光淬灭剂实施封片使用方便，封片后可即时成像拍照，如果染色后不能及时照相，细胞还可以在不高于-20℃的温度下储存4个月之久。

17、不仅如此，本发明的抗淬灭剂在使用前加入dapi，可以将封片和复染一步完成，省去了核染的步骤，节约了时间和成本。

18、进一步，本发明的抗淬灭剂的制备方法简单便捷，因为其本身易于使用且经济实惠利于广泛应用于细胞的荧光信号保护中。

19、本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。