肾上腺素原料药细菌内毒素检测方法与流程

本发明属于细菌内毒素检测，具体涉及一种肾上腺素原料药细菌内毒素的检测方法。

背景技术：

1、细菌内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性菌产生的生物活性大分子物质，细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。细菌内毒素的特点有具有超滤性，过滤不能除去细菌内毒素；不挥发性，蒸馏可除去细菌内毒素；不耐受酸碱，酸碱可灭活细菌内毒素；耐热性，一般热压灭菌不能灭活细菌内毒素。细菌内毒素是注射剂及注射用原料药的主要污染物质，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热，因此必须对注射剂及注射用原料药细菌内毒素进行检测控制。

2、鲎试剂法是细菌内毒素测定的常用方法，它是利用鲎试剂与内毒素发生凝集反应的机理，定性或定量检测药品细菌内毒素的一种体外检测方法。根据测定方法不同，鲎试剂法又分为凝胶法和光度测定法，其凝胶法又分为定性的凝胶限度试验和凝胶半定量试验，凝胶限度试验为仲裁法。

3、肾上腺素是一种直接作用于α、β受体的拟交感类药物，用于心脏骤停和过敏性休克的抢救。肾上腺素注射给药，必须控制原料药及注射液中细菌内毒素。原料药细菌内毒素检测一般将原料药用细菌内毒素检查用水溶解、稀释，然后检测。然而，肾上腺素不溶于水，用混悬液检测可能会因为细菌内毒素被包埋于混悬颗粒中造成检测结果偏差，进而给肾上腺素细菌内毒素检测带来困难。

技术实现思路

1、为克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种肾上腺素原料药细菌内毒素检测方法，其用一定浓度的稀盐酸将肾上腺素原料药溶解制成合适浓度的溶液后进行细菌内毒素检测，该方法具有检测结果准确可靠，方法简便易行，回收试验保证样品溶解过程中细菌内毒素不被灭活的特点。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、肾上腺素(结构如下所示)原料药不溶于水，但分子结构有甲胺基，可与盐酸成盐后溶于水，将肾上腺素溶于稀盐酸形成溶液后再进行内毒素检测。然而，细菌内毒素对酸不稳定，若溶解样品所用的酸太强，则会灭活肾上腺素原料药中的细菌内毒素，造成检验结果假阴性，仔细研究溶解样品所用盐酸的浓度是检测成败的关键。

4、

5、理论上说，肾上腺素与盐酸成盐的摩尔比为1：1。实验发现，当盐酸摩尔数低于肾上腺素摩尔数时，肾上腺素不能溶清，盐酸用量过多时，回收试验不能通过。

6、基于此，研发获得了本技术，具体技术方案如下。

7、一种肾上腺素原料药细菌内毒素检测方法，其包括以下步骤：

8、1)肾上腺素原料药细菌内毒素限度确定，根据中国药典(2020版)，肾上腺素细菌内毒素限度为30eu/mg；

9、2)鲎试剂灵敏度复核，确保试验所用鲎试剂灵敏度在0.5λ～2.0λ之间；

10、3)细菌内毒素干扰预试验，初步确认不存在干扰的供试品浓度；

11、4)细菌内毒素回收试验，确认肾上腺素在溶解过程中细菌内毒素不被盐酸灭活；

12、5)干扰试验，确认不存在干扰的供试品浓度，即在干扰试验条件下试验结果符合要求；

13、6)样品检测，检测三批次样品细菌内毒素，三批次样品检测结果符合要求。

14、具体的，步骤3)中考察的供试品浓度范围为0.032～0.001mg/ml，即初步确认确定肾上腺素最大不干扰浓度，结果表明浓度在0.032mg/ml及以下对鲎试剂凝胶反应无干扰作用。在步骤3)干扰预试验中，用0.11％或0.055％盐酸将供试品样品溶解成2.56mg/ml原液，再用细菌内毒素检查用水将样品稀释到0.032mg/ml及以下对鲎试剂凝胶反应无干扰作用。

15、进一步的，步骤4)中用0.012-0.016％盐酸将肾上腺素原料药溶解制成0.62-0.66mg/ml原液，加入细菌内毒素原液，细菌内毒素检查用水稀释后进行回收试验，确认在样品溶解过程中细菌内毒素不被灭活。结果表明：肾上腺素加入0.012-0.016％盐酸溶液溶解制得含肾上腺素0.62-0.66mg/ml的原液中细菌内毒素仍保持活性，细菌内毒素回收试验符合要求。具体的，在步骤4)细菌内毒素回收试验中，分别用0.11％或0.055％盐酸将样品溶解成2.56mg/ml原液(肾上腺素与盐酸摩尔比分别为1：2和1：1)做细菌内毒素回收试验，结果表明：在此条件下盐酸可将细菌内毒素灭活，回收试验不符合规定。进一步降低盐酸浓度，分别用0.027％或0.014％盐酸将样品溶解成0.64mg/ml原液(肾上腺素与盐酸摩尔比分别为1：2和1：1)，结果表明：前者盐酸可将细菌内毒素灭活，回收试验不符合规定，后者细菌内毒素仍保持活性，回收试验符合规定。可得出结论，用0.014％盐酸将肾上腺素溶解制成0.64mg/ml原液，细菌内毒素活性保持，回收试验符合规定。

16、进一步的，在步骤5)干扰试验中，用0.012-0.016％盐酸将肾上腺素原料药溶解制成0.62-0.66mg/ml原液，再用细菌内毒素检查用水稀释后进行干扰试验，确认此条件下样品对细菌内毒素检测无干扰作用，结果符合要求。

17、进一步的，在步骤6)样品检测中，用0.012-0.016％盐酸将肾上腺素原料药溶解制成0.62-0.66mg/ml原液，再用细菌内毒素检查用水稀释后进行细菌内毒素检测，结果符合要求。

18、进一步的，上述步骤4)、5)、6)中，优选用浓度0.014％盐酸溶解肾上腺素原料药，原液浓度优选为0.64mg/ml。

19、与现有技术相比，本发明检测方法具有以下有益效果：

20、1)肾上腺素不溶于水，直接将肾上腺素加水形成悬浊液进行检测可能因细菌内毒素被样品包裹而使检测结果不准确，本发明将肾上腺素用稀盐酸溶解后进行细菌内毒素检测，细菌内毒素完全溶于水中，检测结果准确可靠；

21、2)盐酸可灭活细菌内毒素，盐酸溶液浓度过大或用量过多时均可灭活细菌内毒素，检测中必须仔细摸索盐酸溶液浓度和盐酸用量，研究发现，肾上腺素用0.014％盐酸溶液溶解得到含肾上腺素0.64mg/ml的溶液(肾上腺素与盐酸摩尔比为1：1)时对细菌内毒素无灭活作用，增加盐酸浓度或盐酸用量均对细菌内毒素有灭活作用；

22、3)在回收试验文献中一般将样品溶解成含细菌内毒素2λ的原液，再用2λ细菌内毒素标准溶液将原料稀释到合适浓度(公伟，王建东，丁酸氯维地平原料药细菌内毒素检查方法的建立，海峡药学，2015，vol 27，p41～43)，这种方法配制的原液中加入的细菌内毒素可能被灭活，即便在原液中不加内毒素，将不加细菌内毒素的原液直接用2λ细菌内毒素标准溶液稀释，只要稀释倍数足够大，回收试验也能符合要求。用这种方法检测样品时即便是样品中细菌内毒素不符合规定，在样品溶解过程中溶剂可能会由于细菌内毒素灭活而得出样品细菌内毒素符合规定的结论。为了避免出现这种情况，本发明的检测方法直接将适量的细菌内毒素加入到原液后再用细菌内毒素检查用水稀释，这样就能反映出溶解样品溶剂是否能灭活细菌内毒素，使检测结果更客观准确。