一种基于代谢组学技术筛选香蕉盐胁迫应答差异代谢物的方法

本发明涉及香蕉差异代谢物鉴别，特别涉及一种基于代谢组学技术筛选香蕉盐胁迫应答差异代谢物的方法。

背景技术：

1、香蕉既是水果又是粮食作物，与苹果、葡萄和柑桔并称为世界四大水果，产量仅次于柑橘类。也是继水稻、小麦和玉米之后位列世界第四的主要粮食作物，全球有130多个国家和地区种植香蕉。近年来，我国香蕉产业发展迅猛，不仅成为南亚热带地区最大宗水果，也是世界贸易量最大鲜果。香蕉产业是我国热区农业的支柱性产业，在我国热带、亚热带作物生产和农业产业结构调整中具有极其重要的社会意义和经济效益。

2、代谢组学是利用高通量检测平台研究样品中差异代谢物的方法，是对生物体内所有代谢物进行定量分析，经过差异代谢物的筛选与参与过程的研究，揭示差异代谢物参与的生命活动机制，其核心价值是通过定性描述和定量表征不同生物基质中小分子代谢组以阐明与细胞代谢相关的所有关键科学问题。应用代谢组学技术分析逆境胁迫下植物体内差异代谢物的调控表达机制已有报道，但目前尚未有利用代谢组学的方法探究香蕉植株在盐胁迫下的代谢差异性的报道。

3、通过比较代谢组学技术，分析并获得盐胁迫下香蕉植株体内的共有差异代谢物及盐胁迫应答相关差异代谢物，对今后深入研究和通过分子手段进行香蕉植株在逆境胁迫条件下的生长调控具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出一种基于代谢组学技术筛选香蕉盐胁迫应答差异代谢物的方法。

2、本发明的目的是研究盐胁迫对香蕉幼苗期差异代谢物的影响作用，为深入挖掘香蕉苗期阶段响应盐胁迫的差异代谢产物、差异性变化等提供详细信息，为生产中调控盐胁迫下植株的生长发育及分子育种等研究提供技术借鉴和理论支持，提供一种响应盐胁迫香蕉差异代谢物的代谢组学分析方法。

3、本发明的技术方案是这样实现的：

4、一种基于代谢组学技术筛选香蕉盐胁迫应答差异代谢物的方法，包括以下步骤：

5、步骤一、在不同盐浓度条件下处理香蕉幼苗，获得盐胁迫组香蕉植株和对照组香蕉植株；

6、步骤二、分别取盐胁迫组香蕉植株和对照组香蕉植株顶部倒数第二片叶片组织处理后用于代谢组材料；

7、步骤三、将步骤二的代谢组材料加入第一份提取液进行混匀提取，加入钢珠进行研磨、超声处理，静置离心后取上清液进行真空干燥处理，随后加入第二份提取液进行复溶再次提取得到待检样本；

8、步骤四、采用液质联用仪(lc-qtof)对步骤三制得的待检样本进行分析检测获得图谱的原始数据；

9、步骤五、使用质谱采集软件(masslynx v4.2,waters)采集原始数据并通过progenesis qi软件对原始数据处理操作，基于progenesis qi软件在线数据库进行鉴定，同时进行理论碎片识别；

10、步骤六、在有峰面积归一化和内标归一化后，进行后续分析和数据库查询，比较分析盐胁迫下香蕉幼苗植株的共有差异代谢物，筛选盐胁迫应答相关差异代谢物。

11、进一步的，步骤一中，具体过程为：先用霍格兰氏营养液对香蕉幼苗进行缓苗，适应一周后，用霍格兰氏营养液中添加nahco3对香蕉幼苗进行处理，以相同量的霍格兰氏营养液培养香蕉幼苗为对照，在相同环境下培养时间8～12天分别得到盐胁迫组香蕉植株和对照组香蕉植株；所述nahco3在霍格兰氏营养液中的浓度为70～90mmol.l-1；所述香蕉幼苗为五叶一心状态。

12、进一步的，所述霍格兰氏营养液的配方为：硝酸钙945mg/l、硝酸钾607mg/l、磷酸铵115mg/l、硫酸镁493mg/l、铁盐溶液2.5ml/l、微量元素5ml/l，ph＝6.0。

13、进一步的，步骤二中，叶片组织处理过程为：采用液氮速冻，在-70～-90℃保存，用于代谢组材料。

14、进一步的，步骤三中，具体过程为：

15、(1)分别称取步骤二的盐胁迫组香蕉植株和对照组香蕉植株的叶片组织40～60mg，加入900～1200μl第一份提取液，涡旋混匀20～30秒得到混合液；

16、(2)将混合液加入钢珠，研磨仪处理8～12min，冰水浴超声8～12min；

17、(3)-20～-30℃下静置1～2h后在3～5℃、10000～12000rpm条件下进行离心12～15min；

18、(4)取400～600μl上清液置于真空浓缩器中在-50～-60℃下干燥64～72h，加入140～180μl第二份提取液复溶再次提取；

19、(5)涡旋混匀20～30秒，冰水浴超声8～10分钟，在3～5℃、10000～12000rpm条件下进行离心12～15min；

20、(6)取100～120μl离心后的上清液于2ml进样瓶，每个样本各取10μl混合成qc样本上机检测。

21、进一步的，步骤(1)中，所述第一份提取液为含有内标的提取液，甲醇乙腈水体积比＝2:2:1，内标浓度20～30mg/l；步骤(4)中，所述第二份提取液中乙腈和水体积比为1:1。

22、进一步的，步骤四中，所述液质联用仪由waters acquity i-class plus超高性能液体串联waters xevo g2-xs qtof高分辨率质谱仪组成；所述waters xevo g2-xs qtof高分辨率质谱仪的esi离子源的参数如下：毛细管电压：正离子模式下为2500v或负离子模式下为-2000v，锥孔电压：30v，离子源温度：100℃，脱溶剂气温度500℃，反吹洗气体流速：50l/h，脱溶剂气体流速：800l/h；质核比(m/z)采集范围50-1200；所述液质联用仪(lc-qtof)的液相条件为：色谱柱acquity uplc hss t3，1.8um，2.1×100mm；正离子模式(pos)：流动相a：0.1％甲酸水溶液，流动相b：0.1％甲酸乙腈；负离子模式(neg)：流动相a：0.1％甲酸水溶液，流动相b：0.1％甲酸乙腈。

23、进一步的，步骤四中，所述液质联用仪(lc-qtof)的液相色谱流动相条件为：

24、

25、进一步的，步骤四中，所述waters xevo g2-xs qtof高分辨率质谱仪在采集软件masslynx v4.2，waters控制下的mse模式进行一级、二级质谱数据采集，在每个数据采集循环中，能够同时对低碰撞能量及高碰撞能量进行双通道数据采集，低碰撞能量2v，高碰撞能量区间为10～40v，扫描频率为0.2秒一张质谱图。

26、进一步的，步骤四中，所述waters xevo g2-xs qtof高分辨率质谱仪的esi离子源的参数如下：毛细管电压：正离子模式下为2500v或负离子模式下为-2000v；锥体电压：30v；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度500℃；反吹气体流速：50l/h；脱溶剂气流速：800l/h；质核比(m/z)采集范围50-1200。

27、进一步的，上述步骤三和四中，所有试剂均为lc-ms级，试剂包括甲醇(methanol)、乙腈(acetonitrile)、l-2-氯苯丙氨酸(2-chloro-l-phenylalanine)、甲酸(formicacid)；其中，甲醇，cas67 56 1，品牌merck；乙腈，cas 75-05-8，品牌merck；l-2-氯苯丙氨酸，cas103616-89-3，品牌上海阿拉丁；甲酸，cas 64-18-6，品牌tci。

28、进一步的，步骤五中，进行理论碎片识别过程，母离子质量数偏差100ppm、碎片离子质量数偏差50ppm以内。

29、进一步的，所述步骤六具体为：数据处理分析部分基于progenesis qi软件在线metlin数据库及公共数据库进行：

30、(1)主成分分析(pca)和斯皮尔曼等级相关系数(spearmanrank correlation)用于数据整体质量评估；

31、(2)在kegg、hmdb和lipidmaps数据库中搜索已鉴定的化合物的分类和途径信息，对代谢物进行注释；

32、(3)对差异分组的样本进行分组主成分分析(pca)及正交偏最小二乘法(opls-da)判别分析；

33、(4)通过置换检验验证opls-da建模的可靠性；基于opls-da结果，从获得的多变量分析opls-da模型的变量重要性投影(vip)初步筛选出组间差异代谢物；

34、(5)结合单变量分析的p-value或差异倍数值fc与vip值相结合的方法进一步筛选差异代谢产物；筛选标准为fc≥1，p值<0.05，vip≥1；

35、(6)利用clusterprofiler选用超几何检验的方法对差异代谢物kegg的注释结果进行富集分析，并绘制相关图形，比较分析盐胁迫下香蕉幼苗的共有差异代谢物，继而筛选出香蕉叶片中盐胁迫相关的差异代谢物。

36、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

37、1、本发明公开了一种基于代谢组学技术筛选香蕉盐胁迫应答差异代谢物的方法，基于液质联用仪(lc-qtof)仪器平台对经过盐胁迫处理的香蕉进行代谢组学分析，通过比较代谢组学研究方法，筛选差异代谢物，该方法的建立可在短期内实现高通量的对香蕉代谢物的获取，同时鉴定出与盐胁迫应答相关的差异代谢物，为今后深入研究和通过分子手段进行香蕉植株在逆境胁迫条件下的生长调控提供了新的途径。

38、2、本发明在对香蕉幼苗进行盐胁迫处理时采用70～90mmol.l-1nahco3对香蕉幼苗进行处理，能够有效获得优良的盐胁迫抗性香蕉幼苗，有利于后续香蕉幼苗代谢物质的提取及后期数据分析中的准确性。

39、3、本发明采用香蕉植株顶部倒数第二片叶片为代谢组材料，具有更充分的保留代谢物质的样本，便于后续提取及验证，从而提高后续分析的准确性。

40、4、本发明对用于代谢组提取样本的材料进行前期预处理，能够有效的提高后期对图谱的去噪，提高匹配的精确度，能够得到更可靠的鉴定结果。

41、5、本发明的方法具有灵敏度高、快速、高选择性的特点。