本发明属于裂壶藻粉中丙二醛检测,尤其涉及一种检测裂壶藻粉中丙二醛的方法。
背景技术:
1、裂壶藻(schizochytrium),又名裂殖壶菌、裂壶藻,属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌,单细胞,球形。裂壶藻细胞富含大量对人体有用的活性物质,如油脂、色素、角鲨烯等。对裂壶藻营养成分研究分析表明,其生化组分主要分为脂类、蛋白质和总糖,其中脂肪含量可占细胞干重的40%以上,而ω-3不饱和脂肪酸dha就高达20%以上。裂壶藻能够在异氧条件下进行发酵培养,易于大规模工业化生产,由于不易被氧化,使用过程中没有污染水质危害,是一种安全有效、高利用价值的海洋微藻。还可以通过培养基及发酵工艺调整来控制细胞内的dha含量,是一种富含dha的重要资源。
2、裂壶藻粉最为显著的品质特征是脂肪含量高且dha含量高,相应的也就容易氧化酸败,如果没有脂肪酸氧化酸败指标的限定,一是不科学,二是对产品使用也是有风险的。但由于裂壶藻的特殊性质,其油脂均在细胞中,裂壶藻藻种细胞不破壁其油脂不会释放,而采用简单的机械破壁或者温湿度条件改变均不会使裂壶藻细胞壁破裂而将油脂释放。
3、丙二醛(mda)是单一具体的物质,且是油脂氧化产物中对动物氧化损伤、对蛋白质和核酸发生交联反应导致损伤的重要有毒有害物质,还能反映藻粉产品中藻油的氧化程度。因此,将丙二醛含量作为藻粉产品中油脂氧化产物程度及有害物质的代表,作为裂壶藻粉产品标准的安全质量指标。
4、裂壶藻粉中丙二醛含量和裂壶藻粉所含粗脂肪中丙二醛含量,这两种检测方式和表述方法最大的不同在于:因裂壶藻粉中粗脂肪含量不同导致丙二醛不能真实反映油脂氧化程度和有害物质含量。例如,以裂壶藻粉中粗脂肪的丙二醛含量计20mg/kg,如果裂壶藻粉中粗脂肪含量为20%,则裂壶藻粉中丙二醛含量为4mg/kg;如果裂壶藻粉中粗脂肪含量为50%,则裂壶藻粉中丙二醛含量为10mg/kg。即如果以裂壶藻粉中丙二醛含量计,后者为前者的2.5倍,或前者为后者的1/4,而实际上以裂壶藻粉所含粗脂肪为基础计二者的氧化程度及有害物质含量是一样的。因此,优选的检测方式应为裂壶藻粉所含粗脂肪中丙二醛含量。由此,提取裂壶藻粉中的粗脂肪将成为裂壶藻粉中丙二醛含量检测的关键。
5、为了保证裂壶藻粉中丙二醛含量检测的准确度,在粗脂肪提取时,既需要将藻粉细胞破壁将脂肪释放又不能在此过程中破坏其脂肪使其氧化。当前常用的破壁方式有:机械破壁、酶解法破壁和冻溶法破壁等,但是,这些破壁方式存在以下缺点:采用机械破壁,效率极低;采用酶解法破壁,其效率高但温度要控制在50℃且对于ph也有要求,因此,破壁过程容易造成脂肪被氧化;采用冻溶法破壁,由于操作过程温度反复变化亦容易造成脂肪被氧化。综上,当前常用的破壁方式不能保证裂壶藻粉中丙二醛含量检测的准确度。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,有效解决当前在提取裂壶藻粉中的粗脂肪时存在的藻粉细胞破壁过程容易造成脂肪氧化的问题。
2、为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,包括以下步骤:
3、s1、破壁:称取一定质量的裂壶藻粉,加入一定体积的盐酸溶液静置,沸水浴和冷冻交替处理至少一次,再加入一定体积的氯仿甲醇混合液,震荡混匀后离心,所述氯仿甲醇混合液中氯仿和甲醇的体积比为1~2:1,所述裂壶藻粉的质量g:盐酸溶液的体积ml:氯仿甲醇混合液的体积ml=1:2~40:10~40;
4、s2、提油:将离心后得到的液相i转移至离心管a中,将离心后得到的固相i继续按步骤s1重复提取一次,将第二次离心后得到的液相ii转移至离心管a中,混匀液相i和液相ii,得到产物i;
5、s3、向产物i中加入与产物i等体积的饱和氯化钠溶液,震荡混匀,离心,将离心后得到的液相iii旋转蒸发,将液相iii中的有机溶剂蒸出后得到产物ii,将产物ii真空干燥,得到粗脂肪;
6、s4、前处理:称取2g所述粗脂肪,向所述粗脂肪中加入三氯乙酸和edta的混合液,混匀后离心,取上清液i备用;
7、s5、衍生化反应:移取等体积的所述上清液i和系列浓度的丙二醛标准溶液分别置于比色管内,各比色管中均加入与上清液i等体积的硫代巴比妥酸水溶液,混匀,置于水浴中保温后取出,再迅速冷却后离心,分别取上清液进行高效液相色谱测定,丙二醛标准溶液和上清液i同步衍生化;
8、s6、将衍生化反应后的系列浓度的丙二醛标准溶液,经高效液相色谱测定后,以丙二醛标准溶液的浓度为x轴,对应的色谱峰面积为y轴制成线性标准曲线,根据所述标准曲线计算裂壶藻粉中丙二醛的含量。
9、进一步地,在步骤s1中,所述盐酸溶液的质量分数为10%~40%,盐酸溶液的体积为1~10ml。
10、进一步地,在步骤s1中,所述静置的时长为30min以上。
11、进一步地,在步骤s1中,所述沸水浴处理时长为1~10min,所述冷冻处理时长为1~30min,所述氯仿甲醇混合液的体积为5~20ml。
12、进一步地,在步骤s4中,所述三氯乙酸和edta的混合液中,三氯乙酸的浓度为8wt%,edta的浓度为0.15wt%。
13、进一步地,在步骤s5中,所述水浴的温度为80~100℃,水浴保温处理时长为20~40min。
14、进一步地,在步骤s5中,所述硫代巴比妥酸水溶液的浓度为0.02mol/l。
15、进一步地,所述高效液相色谱测定以反相c18柱为色谱柱;流动相组成以乙腈和超纯水分别为流动相a和流动相b,体积比例为10~15:85~90;流速为1.0ml/min进行等度洗脱;高效液相色谱检测使用的检测器为紫外检测器,检测波长为532nm;柱温为30℃;进样量为10μl。
16、进一步地,所述丙二醛标准溶液的浓度为0.01、0.05、0.1、0.15、0.25μg/ml。
17、本发明的有益技术效果是:
18、本发明的破壁方式使裂壶藻粉中粗脂肪提取时,既能将藻粉细胞破壁将脂肪释放又不能在此过程中破坏其脂肪使其氧化,从而有效保证了裂壶藻粉中丙二醛含量检测的准确度,同时本发明的方法简单、高效,有利于快速、准确的检测裂壶藻粉中丙二醛的含量。
1.一种检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,在步骤s1中,所述盐酸溶液的质量分数为10%~40%,盐酸溶液的体积为1~10ml。
3.根据权利要求2所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,在步骤s1中,所述静置的时长为30min以上。
4.根据权利要求3所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,在步骤s1中,所述沸水浴处理时长为1~10min,所述冷冻处理时长为1~30min,所述氯仿甲醇混合液的体积为5~20ml。
5.根据权利要求1或4所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,在步骤s4中,所述三氯乙酸和edta的混合液中,三氯乙酸的浓度为8wt%,edta的浓度为0.15wt%。
6.根据权利要求5所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,在步骤s5中,所述水浴的温度为80~100℃,水浴保温处理时长为20~40min。
7.根据权利要求6所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,在步骤s5中,所述硫代巴比妥酸水溶液的浓度为0.02mol/l。
8.根据权利要求7所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,所述高效液相色谱测定以反相c18柱为色谱柱;流动相组成以乙腈和超纯水分别为流动相a和流动相b,体积比例为10~15:85~90;流速为1.0ml/min进行等度洗脱;高效液相色谱检测使用的检测器为紫外检测器,检测波长为532nm;柱温为30℃;进样量为10μl。
9.根据权利要求1所述的检测裂壶藻粉中丙二醛的方法,其特征在于,所述丙二醛标准溶液的浓度为0.01、0.05、0.1、0.15、0.25μg/ml。