测定蛋白质FcRn结合，筛选药物，确定样品稳定性及预测体内PK/PD和半衰期的方法与流程

本申请涉及蛋白质结合测定，具体涉及测定蛋白质fcrn结合，筛选蛋白质药物，确定蛋白质样品稳定性，以及预测含fc大分子药物的体内pk/pd和/或半衰期的方法。

背景技术：

1、抗体是将特定抗原识别连接到免疫系统的不同效应机制的组分。抗体具有两个功能结构域，即fab(抗原结合片段)区和fc区。fab区负责抗原识别，而fc区将抗体与免疫效应细胞耦合。抗体类别切换的过程使得b细胞的重链恒定区，和由此的fc区的表达发生变化，产生具有不同效应功能的fc区。表达这些不同重链的b细胞母细胞和浆细胞的不同定位为五种抗体类别(iga、igd、ige、igg和igm)带来不同的定位和效应细胞识别。

2、在这五种抗体类别中，igg是血清和非粘膜组织中分布最为广泛的类别。igg抗体在针对多种病原体和毒素的保护性免疫方面起到重要作用。作为对其在保护性免疫中的重要作用的证明，长期以来认为igg是唯一一种主动从母体转移到后代从而赋予短期被动免疫的抗体类别，而这种特殊的igg转运是通过新生儿fc受体(fcrn)完成的。fcrn将igg从母体穿过胎盘和小肠近端转移到胎儿。

3、现阶段，生物制药与生物工艺行业的产品主流是使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或双特异抗体。抗体的fc端对新生儿受体亲和力与药物代谢即有效的血药浓度极为相关。目前抗体的fc端与新生儿受体亲和力主要通过elisa及spr等蛋白水平的方式测定，缺少更靠近生理状态下的检测手段，由于蛋白水平的新生儿受体亲和力检测由于其检测手段的局限性有时未能直接反应体内一些大分子在空间构象上的变化，缺乏由更接近于生理状态下的高灵敏检测手段。

4、基于igg的分子的fc区在确定其体内起重要作用，通过其与新生儿fc受体(fcrn)的ph依赖性结合来实现药代动力学特征。由于此ph值特定，与igg-fc相互作用时，fcrn通过维持人类成人中igg稳态，血清igg水平，还将母体igg通过胎盘从母亲转移到胎儿。fc-fcrn相互作用对于维持基于igg的治疗分子的循环也至关重要。目前缺少一种接近于生理状态的基于细胞均质检测新生儿fc受体治疗用单克隆抗体的结合放行和表征方法，可以用作评估批次间的分析工具，可以对同一分子的不同批次进行一致性和稳定性测试。

5、中国专利申请号cn202010822793.0公开了稳定表达hfcrn细胞株的制备方法及其在药物筛选中的应用。虽然该申请使用了表达hfcrn的细胞，但是其并没有用于直接检测抗体与fcrn结合，而是用于检测跨膜转运的抗体和筛选对hfcrn介导的细胞内吞、外泌再循环及跨膜转运有影响的化合物。该申请仍然没有解决提供更精确更灵敏地检测生物大分子，尤其是抗体，并且更靠近生理状态下的检测手段的问题。

6、与其他蛋白质或小分子相比，抗体之所以在体内有很长的半衰期，一个重要原因是能够和一种特殊的fc受体fcrn结合。fcrn受体的结构是由一条alpha链和beta微球蛋白构成。fcrn在体内有广泛的表达，包括许多组织的上皮，内皮细胞及多种免疫细胞(如单核巨噬细胞)等。fcrn与igg的结合是ph依赖型的：只在弱酸性ph6.0左右结合，而在中性ph无结合。当血液中的游离抗体被细胞非特异的内吞至胞内体(endosome)中，由于胞内体内部ph为弱酸性(5～6)，igg通过抗体的fc区与fcrn结合。结合后的抗体随fcrn转运至细胞膜表面，由于细胞外液ph为近中性(～7.4)，此时igg与fcrn失去结合，重新进入血液循环，从而延长了igg在体内的半衰期。而其他不能和fcrn结合的蛋白，在胞内体内不能被fcrn回收，最终进入溶酶体降解，导致了较短的半衰期。

7、本领域仍然需要寻找一种能在更靠近生理状态下，更精确更灵敏地检测生物大分子，尤其是抗体，筛选蛋白质药物和确定蛋白质样品稳定性以及帮助预测含fc大分子药物的体内pk/pd和/或半衰期的方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本申请的一个方面提供一种测定蛋白质fcrn结合的方法，所述方法包括：

2、(a)在固体支持物上固定表达fcrn的细胞；

3、(b)将所述固体支持物与封闭剂孵育；

4、(c)用第一分子标记所述蛋白质，并在酸性ph下，将所述标记的蛋白质与所述固体支持物孵育；

5、(d)将第二分子与所述固体支持物孵育，所述第二分子与所述第一分子特异性结合；和

6、(e)检测所述第一分子与所述第二分子的结合。

7、本申请的另一个方面提供了一种筛选蛋白质药物的方法，所述方法包括：

8、(1)通过包括以下步骤的方法测定多种蛋白质候选物的fcrn结合：

9、(a)在固体支持物上固定表达fcrn的细胞；

10、(b)将所述固体支持物与封闭剂孵育；

11、(c)用第一分子标记所述蛋白质，并在酸性ph下，将所述标记的蛋白质与所述固体支持物孵育；

12、(d)将第二分子与所述固体支持物孵育，所述第二分子与所述第一分子特异性结合；和

13、(e)检测所述第一分子与所述第二分子的结合；和

14、(2)根据所述多种蛋白质候选物的fcrn结合筛选所述蛋白质药物。

15、本申请的另一个方面提供了一种确定蛋白质样品稳定性的方法，所述方法包括：

16、(1)通过包括以下步骤的方法测定多个蛋白质样品的fcrn结合：

17、(a)在固体支持物上固定表达fcrn的细胞；

18、(b)将所述固体支持物与封闭剂孵育；

19、(c)用第一分子标记所述蛋白质，并在酸性ph下，将所述标记的蛋白质与所述固体支持物孵育；

20、(d)将第二分子与所述固体支持物孵育，所述第二分子与所述第一分子特异性结合；和

21、(e)检测所述第一分子与所述第二分子的结合；和

22、(2)比较所述多个蛋白质样品的fcrn结合，从而确定所述多个蛋白质样品的稳定性。

23、本申请的另一个方面提供了一种预测含fc大分子药物的体内pk/pd和/或半衰期的方法，所述方法包括：

24、(1)通过包括以下步骤的方法测定所述含fc大分子药物的fcrn结合：

25、(a)在固体支持物上固定表达fcrn的细胞；

26、(b)将所述固体支持物与封闭剂孵育；

27、(c)用第一分子标记所述蛋白质，并在酸性ph下，将所述标记的蛋白质与所述固体支持物孵育；

28、(d)将第二分子与所述固体支持物孵育，所述第二分子与所述第一分子特异性结合；和

29、(e)检测所述第一分子与所述第二分子的结合；和

30、(2)预测所述含fc大分子药物的体内pk/pd和/或半衰期。

技术特征：

1.一种测定蛋白质fcrn结合的方法，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包括含抗体fc区的蛋白质，例如，fc融合蛋白，抗体，优选单克隆抗体，igg。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物包括多孔板，优选高吸附性多孔板，例如，石墨电极高吸附性多孔板。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述表达fcrn的细胞包括真核细胞，优选人类细胞，例如，人类胚胎肾细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分子包括生物素；并且所述第二分子包括亲和素或链霉亲和素。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述酸性ph为5.0-7.0，优选5.5-6.5，更优选6.0。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二分子用酶标记，并且步骤(e)还包括加入所述酶的底物并检测底物反应，优选地，所述底物反应包括显色反应。

8.一种筛选药物的方法，所述方法包括：

9.一种确定蛋白质样品稳定性的方法，所述方法包括：

10.一种预测含fc大分子药物的体内pk/pd和/或半衰期的方法，所述方法包括：

技术总结
本申请公开了测定蛋白质FcRn结合，筛选药物，确定样品稳定性及预测体内PK/PD和半衰期的方法。其中测定蛋白质FcRn结合的方法包括：(a)在固体支持物上固定表达FcRn的细胞；(b)将所述固体支持物与封闭剂孵育；(c)用第一分子标记所述蛋白质，并在酸性pH下，将所述标记的蛋白质与所述固体支持物孵育；(d)将第二分子与所述固体支持物孵育，所述第二分子与所述第一分子特异性结合；和(e)检测所述第一分子与所述第二分子的结合。

技术研发人员：徐素蕾,贾晓青,张舒蓉,张春艳
受保护的技术使用者：上海药明生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29