人类辅助生殖用液中糖类物质含量的检测方法与流程

本发明涉及检测分析领域，特别是涉及一种人类辅助生殖用液中糖类物质含量的检测方法。

背景技术：

1、人类辅助生殖用液(简称art用液)是指与人类配子和/或胚胎发生直接或间接接触，以准备、培养、转移或存储人类配子和/或胚胎的液体类医疗器械产品，此类产品在我国被作为第三类医疗器械进行管理，通常包括人类辅助生殖培养液及保存液等。在人类辅助生殖用液中，蔗糖、葡萄糖、海藻糖和果糖被广泛使用。蔗糖是一种非还原性二糖，在人类辅助生殖技术用培养液及保存液中作为防冻保护剂，并具有一定的渗透压保护功能。葡萄糖用来作为胚胎体外生长发育的一种能量物质。海藻糖用来作为膜非通透性冷冻保护剂，能够在配子或胚胎冷冻保存和解冻复苏过程中保护细胞，预防或减轻冷冻损伤。果糖用来作为一种能量物质，通常添加在受精培养液内，为精子的活动提供相应的能源和动力，促进精子获能。

2、国内已上市art用液均为进口产品，国产化的主要障碍即临床安全问题。因此，建立一种测定人类辅助生殖用液中多种糖类物质含量的方法是质量控制与安全评价的一个重要手段。但是对于体外辅助生殖用液检测技术的研究目前尚处于起步阶段，相关研究较少。

3、传统技术公开了一种基于液相色谱评价art用液质量的方法。然而该方法未能用同一种方法测定葡萄糖、蔗糖、海藻糖，评价方法也未包含对果糖的评价，且糖类物质分析时间最少为20min。另外，由于art用液中的蔗糖通常为高浓度，葡萄糖通常为低浓度，两者在测定时往往存在干扰；该方法是通过分组测试及不同色谱条件的相互配合才解决高浓度蔗糖和低浓度葡萄糖测定之间相互干扰的问题，工艺复杂。

4、另有传统技术公开了一种art用液中葡萄糖的液质联用检测方法。该方法虽然灵敏度高，分析时间短，专属性好，但是只能检测葡萄糖，未包含海藻糖、果糖和蔗糖的检测，且液质联用仪价格昂贵，操作复杂，对人员专业技术能力要求高，不适用于企业的广泛应用。

技术实现思路

1、基于此，本发明一些实施例提供一种人类辅助生殖用液中糖类物质含量的检测方法，该方法能够简单快速、低成本地同时测试人类辅助生殖用液中多种糖类物质的含量。

2、一种人类辅助生殖用液中糖类物质含量的检测方法，包括如下步骤：

3、提供人类辅助生殖用液的待测样品；

4、对待测样品进行前处理，所述前处理的步骤包括：将所述待测样品与乙腈以体积比为1:1～2:1的比例混合，在2℃～8℃下冷藏20min～30min，然后离心处理，取上清液用流动相稀释至预设浓度；或者，将所述待测样品直接用超滤离心管进行离心处理，然后取上清液用流动相稀释至预设浓度；

5、采用高效液相色谱对经前处理后的待测样品中的多种糖类物质含量同时进行检测，所述糖类物质至少包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖及果糖，色谱条件包括：

6、色谱柱包括酰胺基色谱柱；

7、流动相包括体积比为7:3～8:2的乙腈和水的混合液，ph为9.7～11。

8、在其中一些实施例中，所述色谱柱包括酰胺基键合亚乙基桥杂化颗粒色谱柱。

9、在其中一些实施例中，所述色谱条件还包括：

10、(1)流速为0.8ml/min～1.2ml/min；

11、(2)柱温为35℃～45℃，进样量为20μl～50μl；

12、(3)检测器包括示差折光检测器及蒸发光散射检测器中的一种；

13、(4)示差折光检测器的温度为35℃～45℃；

14、(5)蒸发光散射检测器条件：漂移管温度80～90℃；

15、(6)蒸发光散射检测器氮气压力350kpa，撞击器关，或者，氮气流量2.1ml/min，不分流。

16、在其中一些实施例中，离心处理的步骤中，在6000r/min～10000r/min的条件下离心5min～10min；和/或，所述超滤离心管的截留分子量为10kd～30kd。

17、在其中一些实施例中，所述葡萄糖的预设浓度为10mg/l～500mg/l，所述蔗糖的预设浓度为50mg/l～2500mg/l，所述果糖的预设浓度为10mg/l～500mg/l，所述海藻糖的预设浓度为50mg/l～2500mg/l。

18、在其中一些实施例中，在采用高效液相色谱对经前处理后的待测样品中的多种糖类物质含量同时进行检测的步骤之前，还包括：

19、获得多个标准混合液，多个所述标准混合液中均含有葡萄糖、蔗糖、海藻糖和果糖，且多个所述标准混合液中葡萄糖、蔗糖、海藻糖和果糖的浓度不同；

20、用高效液相色谱分别对多个所述标准混合液进行测试，色谱条件与对所述待测样品进行检测的色谱条件相同，得到每个所述标准混合液中各糖类物质的峰面积；

21、根据每个所述标准混合液中各糖类物质的峰面积及各糖类物质的浓度，得到各糖类物质的浓度与峰面积的线性关系；

22、在对所述待测样品中的多种糖类物质含量同时进行检测的步骤中，根据所述待测样品中各糖类物质的峰面积和所述线性关系，得到所述待测样品中各糖类物质的含量。

23、在其中一些实施例中，多个所述标准混合液的制备步骤如下：

24、配制葡萄糖标准母液、蔗糖标准母液、海藻糖标准母液和果糖标准母液；

25、取部分所述葡萄糖标准母液、部分所述蔗糖标准母液、部分所述海藻糖标准母液和部分所述果糖标准母液混合，再用所述流动相进行稀释，配制多个所述标准混合液。

26、在其中一些实施例中，采用高效液相色谱对经前处理后的待测样品中的多种糖类物质含量同时进行检测的步骤中，所述糖类物质的出峰时间≤10min。

27、在其中一些实施例中，所述待测样品包括玻璃化冷冻液、洗精受精液、配子缓冲液及精子冻存液中的一种或几种。

28、在其中一些实施例中，所述检测方法包括如下步骤：

29、获得多个标准混合液，多个标准混合液中均含有葡萄糖、蔗糖、海藻糖和果糖，且多个所述标准混合液中葡萄糖、蔗糖、海藻糖和果糖的浓度不同；

30、用高效液相色谱分别对多个所述标准混合液进行测试，色谱条件包括：色谱柱包括酰胺基键合亚乙基桥杂化颗粒色谱柱；流动相包括体积比为7:3～8:2的乙腈和水的混合液，ph为9.7～11，得到每个所述标准混合液中各糖类物质的峰面积；

31、根据每个所述标准混合液中各糖类物质的峰面积及各糖类物质的浓度，得到各糖类物质的浓度与峰面积的线性关系；

32、将待测样品与乙腈以体积比为1:1～2:1的比例混合，在2℃～8℃下冷藏20min～30min，然后在6000r/min～10000r/min的条件下离心5min～10min，取上清液用流动相稀释至预设浓度；

33、利用高效液相色谱对所述待测样品进行检测，色谱条件与对多个所述标准混合液进行测试的色谱条件相同，得到所述待测样品中各糖类物质的峰面积；

34、根据所述待测样品中各糖类物质的峰面积和所述线性关系，得到所述待测样品中各糖类物质的含量。

35、上述人类辅助生殖用液中糖类物质含量的检测方法采用高效液相色谱对待测样品进行检测，较采用液质联用仪的方法降低了成本，更适合广泛应用，且在对待测样品检测之前先进行前处理，通过将待测样品与乙腈混合冷藏后离心处理或者用超滤离心管离心的方式处理，以除去待测样品中的人血红蛋白，降低长期测试人血红蛋白会堵塞色谱柱的风险，进而延长色谱柱的使用寿命，进一步降低成本。采用流动相进行稀释有利于提高分离度，获得更好的峰形，从而进一步提高定量检测的准确性。在色谱检测过程中，通过选择合适的酰胺基色谱柱，较常规的硅胶氨基柱而言一方面寿命更长，因为它的键合相稳定，另一方面，酰胺基色谱柱结合选择合理的有机相与水的比例，使得短期时间内能够进行目标物分离，并调节流动相的ph来修饰峰形，使得能够同时测定葡萄糖、蔗糖、海藻糖和果糖等多种糖类物质含量，降低了不同物质间的干扰，分离度好，分析时间短，解决了传统检测方法所存在的测试干扰及测试周期长、效率低的问题。